Notch通路及Snail在大鼠肝纤维化发生发展中的作用

赵文冰，孔心涓，姜英俊，赵文君

（青岛大学医学院附属医院消化科，山东 青岛 266003）

肝纤维化发生机制复杂，多种因素如细胞、细胞因子及细胞信号通路等均参与其中。前期研究表明，Notch－1在肝纤维化发生发展中发挥重要作用，且与上皮－间质转化（EMT）密切相关［1］。有研究结果证实，EMT 参与肺［2］、肾［3］等纤维化过程，且锌指蛋白（Snail－1）是EMT的关键因子。在肝纤维化中，Snail－1是否参与EMT过程，与Notch通路是否存在内在联系？目前尚需研究证实。为研究Notch通路、Snail－1在肝纤维化中的作用及两者之间的联系，本研究应用四氯化碳（CCL4）诱导大鼠肝纤维化模型，探讨二者在肝纤维化中的作用与关系。

1 材料与方法

1.1 动物及分组

取雄性 Wistar大鼠60只，体质量（200±20）g，购于青岛派特福德白鼠养殖专业合作社。实验前适应性饲养10d，普通饮食。随机分为对照组、模型组、药物组，每组20只大鼠。

1.2 药物

扶正化瘀干膏粉由上海黄海制药有限责任公司提供，制备成含生药46g／L的溶液。

1.3 主要试剂

Notch－1抗体、E－钙黏素（E－cadherin）及兔抗鼠IgG抗体（PV－6002）均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。Notch配体（Jagged－1）抗体、Snail－1抗体及α－平滑肌肌动蛋白（α－SMA）抗体购自博奥森生物技术有限公司。

1.4 方法

1.4.1 模型制备 将CCL4溶液与橄榄油以4∶6配成体积分数0.40的油剂（模型组及药物组皮下注射CCL4油剂，首剂量5mL／kg，以后3mL／kg），对照组大鼠皮下注射等剂量橄榄油，每周2次，共8周。造模开始药物组以扶正化瘀方溶液4.6g／kg灌胃，灌胃容积为10mL／kg（剂量相当于体质量为60kg成人每千克体质量用量的10倍）；对照组及模型组以相同容积的生理盐水灌胃，每天1次，共8周。每周称体质量1次，观察动物一般状况及毛发的变化。

1.4.2 样本的采集及处理 实验8周末，大鼠禁食12h，水合氯醛腹腔注射麻醉，取每只大鼠肝右叶相同部位组织1块，置入40g／L的中性甲醛溶液中固定，常规石蜡包埋。

1.4.3 肝脏组织病理学检查 肝组织石蜡包埋，连续2μm厚切片，苏木精－伊红（HE）染色，每张切片随机选5个不重叠视野，光学显微镜下观察，肝纤维化的分级按照2000年（西安）修订的肝脏病理组织学标准进行［4］。

1.4.4 免疫组织化学染色 切片置于60℃烤箱过夜，二甲苯脱蜡，乙醇梯度水化；蒸馏水冲洗2min，分别入pH 9.0 的 EDTA 修复液（Jagged－1、Snail－1、α－SMA）与pH 6.0枸橼酸盐修复液（Notch－1、E－cadherin）中，置于高压锅内130℃修复100s后自然凉干；分别置入体积分数0.03的过氧化氢溶液10min，PBS（pH 7.4）冲洗4次，每次1.5min；分别加一抗 Jagged－1（1∶150）、Snail－1（1∶50）、α－SMA（1∶150）、Notch－1（1∶100）、E－cadherin（1∶100），放入37℃恒温水浴箱孵育60min；PBS（pH 7.4）冲洗4次；加二抗37℃孵育20min，PBS（pH 7.4）冲洗4次，DAB显色，苏木精复染；梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片；镜检。

1.4.5 肝组织中各种蛋白表达的检测 取5个较好的高倍视野，按显色程度的深浅计分。1分：弱阳性，2分：阳性，3分：强阳性。按着色细胞百分比计分。1分：≤25%，2分：26%～50%，3分：51%～75%，4分：≥76%。然后计算显色指数。显色指数＝显色程度计分×着色细胞百分比计分，取其均数作为每个指标的最终显色指数，采用双盲法阅片。

1.5 统计学处理

以PPMS 1.5［5］统计软件进行统计处理，计量资料以表示，多个样本均数比较采用单因素方差分析，多组间两两比较采用q检验；两个变量之间的相关关系采用Pearson相关分析，以P＜0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 大鼠的一般情况

对照组大鼠状况良好，行为与饮食量正常，毛发白色有光泽，体质量增加。模型组注射CCL4后，活动逐渐减少，精神萎靡，嗜睡，摄食少，体质量增长缓慢，毛发暗黄，注射CCL4部位溃疡、结痂，周围毛发脱落，部分大鼠有腹水形成。药物组一般状态及注射CCL4部位溃疡愈合能力好于模型组。造模期间模型组大鼠死亡3只，药物组大鼠死亡1只。

2.2 大鼠肝组织病理学检查

2.2.1 肉眼观察 对照组大鼠肝表面光滑，颜色鲜红，肝包膜完整，质软，边缘锐利；模型组大鼠肝表面凹凸不平，有结节形成，颜色灰白，质硬；药物组肝脏大，边缘钝圆，肝表面有细颗粒形成，触之粗糙，颜色暗红，质韧。

2.2.2 HE染色 对照组大鼠肝细胞呈单核，肝小叶结构正常，肝细胞围绕中央静脉呈放射状排列，无炎症细胞浸润（图1A）。模型组肝小叶失去正常结构，肝细胞索排列紊乱，细胞广泛的脂肪变性、坏死，炎性细胞浸润；汇管区纤维组织大量增生，汇管区或中央静脉区伸出纤维条索包绕肝组织，形成假小叶（图1B）。药物组肝细胞脂肪变性，汇管区炎性细胞浸润，纤维组织中度增生，有保存较完整的肝组织结构（图1C）。

2.2.3 大鼠肝组织中各种蛋白的表达 大鼠肝组织中Jagged－1、Notch－1、Snail－1、α－SMA 蛋白主要表达于细胞质，细胞质呈棕黄色着色，细胞核呈淡蓝色着色。E－cadherin蛋白主要表达于细胞膜，呈黄色或棕黄色着色。与对照组相比，模型组肝组织Jagged－1、Notch－1、Snail－1、α－SMA表达水平明显升高，E－cadherin表达水平明显下降，差异有显著意义（F＝190.415～608.534，q＝26.691～48.437，P＜0.01）。与模型组比较，药物组大鼠肝组织内Jagged－1、Notch－1、Snail－1、α－SMA 表达水平下降，E－cadherin表达水平升高，差异有显著性（q＝8.336～33.962，P＜0.01）。见表1。

图1 各组肝组织形态学改变

表1 各组大鼠肝组织中各种蛋白质的表达（）

表1 各组大鼠肝组织中各种蛋白质的表达（）

与对照组比较，F＝190.415～608.534，＃q＝26.691～48.437，P＜0.01；与模型组比较，＊q＝8.336～33.962，P＜0.01。

－SMA对照组 20 2.97±0.48 1.76±0.56 3.18±0.37 8.07±1.49 2.23±0.44模型组 17 7.95±1.05＃ 9.37±0.95＃ 9.68±0.80＃ 1.65±0.55＃ 9.44±0.96＃药物组 19 4.32±0.58＊ 3.97±0.45＊ 5.85±0.75＊ 3.68±0.72＊ 5.43±1.06组别 n Jagged－1 Notch－1 Snail－1 E－cadherin α＊

2.3 各组大鼠肝组织各项观察指标间的相关性

Jagged－1与 Notch－1、Snail－1及α－SMA 表达呈正相关，与E－cadherin表达呈负相关（r＝－0.82～0.94，P＜0.01）；Notch－1与 Snail－1、α－SMA 表达呈正相关，与E－cadherin表达呈负相关（r＝－0.83～0.95，P＜0.01）；Snail－1与α－SMA 表达呈正相关，与E－cadherin表达呈负相关（r＝0.95、－0.85，P＜0.01），E－cadherin与 α－SMA表达呈负相关（r＝－0.88，P＜0.01）

3 讨 论

近年来研究显示，Notch通路调控异常影响肝纤维化的发生、发展。在哺乳动物胚胎时期，肝组织中Notch通路表达活跃，当肝脏分化发育成熟后，Notch通路在肝组织几乎不表达，而在胆管闭锁引起的肝硬化及原发性胆汁性肝硬化病人肝组织中，Notch通路被重新激活［6－7］。叶超等［8］研究结果显示，Jagged－1、Notch－1可能参与肝纤维化的发生、发展，并与严重程度密切相关。本实验经过8周造模后，HE染色结果显示，模型组肝小叶失去正常结构，汇管区纤维组织大量增生，包绕肝组织，形成假小叶。免疫组化检测结果显示，Jagged－1、Notch－1、Snail－1、α－SMA蛋白表达于胞质，呈棕黄色着色，E－cadherin在细胞膜几乎不表达，提示造模成功。但Notch通路通过哪些具体的分子机制介导肝纤维化发生、发展，目前尚不清楚。

已有研究结果显示，肝纤维化与EMT过程息息相关［9－10］。EMT是指肝细胞、肝星状细胞、胆管细胞等在各种生理、病理情况下失去细胞之间的黏附分子E－cadherin，获得间质细胞特异性蛋白（α－SMA、波形丝蛋白、纤维连接蛋白），并转变成为肌成纤维细胞，此细胞可持续产生Ⅳ胶原并沉积于肝组织中，致肝脏组织结构紊乱，肝纤维化发生的过程。Snail－1在 EMT中起着关键作用［11－12］，Snail基因含有一个CAGGTG核心，可与E－cadherin启动子上的E－box元件结合，抑制E－cadherin转录，使E－cadherin表达下降，α－SMA表达上升。那么在肝纤维化组织中，Notch通路是否与Snail－1及EMT过程有关联？对TGF－β与Ang－Ⅱ联合诱导人肾小管上皮细胞及体外培养的永生内皮细胞系的研究显示，过度表达Notch－1诱导Snail－1高表达，抑制E－cadherin基因转录，增加α－SMA表达，同时伴随细胞间接触消失，成纤维细胞生成［13－14］。给予 Notch－1及Snail－1抑制剂将会抑制EMT过程。因此，我们推测在肝纤维组织中也可能存在类似的结果。

本实验检测3组大鼠肝组织Jagged－1、Notch－1、Snail－1、E－cadherin、α－SMA的表达，结果显示，模型组肝细胞膜上E－cadherin几乎不表达，Jagged－1、Notch－1、Snail－1 及α－SMA在肝细胞质内过度表达；而对照组肝细胞膜上E－cadherin表达量极高，相反其余4项在肝细胞质内表达水平低下。经统计分析后显示，Jagged－1、Notch－1与Snail－1表达水平呈正相关，与E－cadherin表达呈负相关。这些结果提示Notch通路可能通过上调Snail－1的表达参与肝纤维化中EMT过程。

扶正化瘀方在治疗纤维化方面已经处于Ⅱ期临床研究阶段。扶正化瘀胶囊与维生素E联合应用，可逆转TGF－β1诱导的EMT过程，抑制肾纤维化发生［15］。本实验药物组E－cadherin表达水平较模型组高，其余4项蛋白表达水平低于模型组，提示扶正化瘀方溶液可能通过抑制Notch通路及Snail－1的表达，从而减轻肝纤维化的程度。

总之，我们认为Notch通路通过上调Snail－1参与EMT过程，最终致肝纤维化发生、发展。抑制Notch通路可能是扶正化瘀方抑制肝纤维化进展机制之一。对于Notch通路及Snail－1研究，可能有助于了解肝纤维化的发病机制，为寻找有效治疗肝纤维化的药物提供实验依据。

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