hUCMSCs并西格列汀对糖尿病大鼠肝脏蛋白激酶B表达影响

聂静，王颜刚

（青岛大学医学院附属医院内分泌科，山东 青岛 266071）

间充质干细胞（MSCs）是多潜能、自我更新细胞，能分泌多种营养因子和免疫调节因子，参与各种组织器官的修复［1－3］，近年来 MSCs在糖尿病治疗方面作用引起了全球广泛关注。而人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）具有来源丰富、采集简便、增殖能力强、免疫原性低等优点，成为MSCs临床应用最有前途的细胞来源之一［4］。本研究选择雄性 Wistar大鼠制备链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠模型，静脉应用hUCMSCs及联合西格列汀进行干预，观察其对大鼠肝脏蛋白激酶B（AKT）表达的影响。现将结果报告如下。

1 材料和方法

1.1 实验材料

取8周龄健康雄性SPF级Wistar大鼠32只，体质量（200±20）g，购自山东鲁抗医药股份有限公司。hUCMSCs来源于我院中美干细胞中心，其需氧菌、厌氧菌、真菌、支原体等微生物检测结果均为阴性，细胞表面抗原检测符合MSCs的表型特征：CD34－，CD45－，HLA－DR－，CD90＋，CD105＋，用PBS稀释至细胞密度为0.5×109／L。主要试剂如下：DMEM 低糖培养基、胎牛血清、5g／L胰酶、STZ，美国Sigma公司；青霉素及链霉素、PBS，西安沃尔森生物技术有限公司；高糖高脂饲料，北京华阜康生物科技股份有限公司；兔抗鼠AKT单克隆抗体，美国Proteintech公司；DAB显色试剂盒，武汉博士德公司。

1.2 实验方法

1.2.1 糖尿病大鼠模型的建立 Wistar大鼠适应性饲养1周，随机分为糖尿病组（24只）及正常对照组（8只）。糖尿病组先给予高糖高脂饮食6周，然后给予小剂量STZ（30mg／kg）腹腔注射，10d后连续两次检测空腹血糖≥11.1mmol／L即认为造模成功，成模后给予普通饲料喂养。正常对照组给予普通饲料喂养。

1.2.2 实验分组及处理方法 将成功建模后的糖尿病大鼠随机分为糖尿病对照组、hUCMSCs组以及hUCMSCs联合西格列汀治疗组（联合组），每组8只。hUCMSCs组：分别在成模后第1、5周给予大鼠尾静脉注射hUCMSCs，每只2mL（1.0×106个细胞）；联合组：造模成功后开始给予大鼠西格列汀10mg／（kg·d）灌胃治疗10周，分别在造模成功后第1、5周给予大鼠尾静脉注射hUCMSCs治疗，每只2mL（1.0×106个细胞）；正常对照组与糖尿病对照组不予治疗。

1.2.3 肝脏组织AKT表达检测 采用免疫组织化学染色方法进行检测。成模后第10周处死各组大鼠，取出肝脏组织，置于40g／L甲醛溶液中固定24h，脱水、石蜡包埋、切片，行免疫组化染色检测，光学显微镜下（200倍）观察各组AKT胞浆着色情况，每张图片观察4个视野。AKT定位于细胞质，无背景着色情况下均以细胞浆出现黄色颗粒者为阳性。免疫组化染色结果采用半定量评分方法判定：①计算阳性细胞百分数并赋予分值，≤5%为0分，6%～25%为1分，26%～50%为2分，51%～75%为3分，＞75%为4分；②观察着色强度并赋予分值，无色为0分，浅黄色为1分，黄色为2分，棕黄色为3分。以阳性细胞百分数分值与着色强度分值乘积判定结果：0分为（－），1～4分为（＋），5～8分为（），9～12分为（）。

1.3 统计学处理

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据处理，数据间比较采用秩和检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

联合组及hUCMSCs组肝脏组织AKT表达均明显高于糖尿病对照组，但低于正常对照组，差异有显著性（Hc＝25.085，q＝3.211～9.275，P＜0.05），联合组高于hUCMSCs组（q＝5.967，P＜0.05）。见表1、图1。

表1 各组大鼠肝脏组织AKT表达比较（n＝8，只）

3 讨 论

AKT信号通路是胰岛素主要的下游分子通路。AKT通过对葡萄糖转运、糖原合成、糖酵解和糖异生的调节及其基因突变、沉默、敲除和AKT酶活性改变，影响着葡萄糖的代谢及糖尿病的发生、发展。AKT磷酸化通过胰岛素依赖的方式进行，可在三个水平上调控葡萄糖代谢。①AKT通过诱导葡萄糖转运蛋白GLUT1和GLUT3的表达及GLUT4向质膜的移位促进葡萄糖摄取；此外，AKT通过增加内吞影响葡萄糖转运，从而维持血糖稳定［5］。②通过糖原合成酶激酶3（GSK3）促进糖原合成。③通过磷酸果糖激酶2（6－PF2－K）诱导糖酵解。AKT调控严密精确，其调控紊乱可引起多种疾病，如糖尿病等。已有研究显示，AKT敲除的小鼠会出现糖尿病，并且胰岛素靶组织对葡萄糖利用减少［6］。BAE等［7］研究显示，在AKT基因敲除的脂肪细胞中，通过过表达AKT的方式，可以恢复正常胰岛素介导的葡萄糖摄取。

近年来，MSCs在糖尿病治疗方面作用引起了广泛关注。多项研究已经证明，MSCs在体外胰岛细胞培养条件诱导下，具有向胰岛素分泌细胞分化的潜能，表达与功能性胰岛β细胞生成相关的多个基因，并能以葡萄糖依赖方式释放胰岛素，移植到体内能使STZ诱导的裸鼠糖尿病症状减轻［8－10］。在各种来源的MSCs中，hUCMSCs因具有来源丰富、易于获得、采集简便、免疫原性低等优势，具有更广泛的应用与研究价值［11－13］。而西格列汀（DPP－4抑制剂）能够通过减少GLP－1在体内的降解而降低血糖水平，已广泛应用于2型糖尿病的治疗［14］。肝脏是胰岛素作用的重要靶组织，本实验结果显示，hUCMSCs组及hUCMSCs联合西格列汀组大鼠肝脏组织中AKT的表达均明显高于糖尿病对照组，表明hUCMSCs移植能改善糖尿病引起的AKT表达降低。西格列汀可能通过减少GLP－1在体内的降解而降低血糖，从而加强hUCMSCs改善糖尿病大鼠由于血糖过高引起的AKT表达降低作用。

图1 各组大鼠肝脏AKT免疫组化染色结果

综上所述，hUCMSCs联合西格列汀治疗能改善因糖尿病引起的AKT表达降低，可能为2型糖尿病治疗提供新思路。

［1］CICERI F，PIEMONTI L.Bone marrow and pancreatic islets：an old story with new perspectives［J］.Cell Transplantation，2010，19（12）：1511－1522.

［2］SIMARD A R，SOULET D，GOWING G，et al.Bone marrow－derived microglia play a critical role in restricting senile plaque formatifon in Alzheimer’s disease［J］.Neuron，2006，49（4）：489－502.

［3］VALLE－PRIETO A，CONGET P A.Human mesenchymal stem cells efficiently manage oxidative stress［J］.Stem Cells and Development，2010，19（12）：1885－1893.

［4］LU L L，LIU Y J，YANG S G，et al.Isolation and characterization of human umbilical cord mesenchymal stem cells with hematopoiesis－supportive function and other potentials［J］.Haematologica，2006，91（8）：1017－1026.

［5］张青青，董果雄，张社华.全反式维甲酸对兔颈动脉粥样硬化病灶VSMC增殖及AKT1表达影响［J］.青岛大学医学院学报，2010，46（2）：135－137.

［6］CHO H，MU J，KIM J K，et al.Insulin resistance and a diabetes mellitus－like syndrome in mice lacking the protein kinase Akt2（PKB beta）［J］.Science，2001，292（5522）：1728－1731.

［7］BAE S S，CHO H，MU J，et al.Isoform－specific regulation of insulin－dependent glucose uptake by Akt／protein kinase B［J］.The Journal of Biological Chemistry，2003，278（49）：49530－49536.

［8］刘斌钰，李宁毅，樊功为，等.大鼠骨髓间充质干细胞的培养鉴定及向成骨细胞诱导分化研究［J］.齐鲁医学杂志，2007，22（3）：215－217.

［9］VOLAREVIC V，ARSENIJEVIC N，LUKIC M L，et al.Concise review：mesenchymal stem cell treatment of the complications of diabetes mellitus［J］.Stem Cells，2011，29（1）：5－10.

［10］XIE Q P，HUANG H，XU B，et al.Human bone marrow mesenchymal stem cells differentiate into insulin－producing cells upon microenvironmental manipulation in vitro［J］.Differentiation，2009，77（5）：483－491.

［11］VERSPOHL E J.Novel therapeutics for type 2diabetes：incretin hormone mimetics（glucagon－like peptide－1receptor agonists）and dipeptidyl peptidase－4inhibitors［J］.Pharmacology＆ Therapeutics，2009，124（1）：113－138.

［12］HARE J M.Translational development of mesenchymal stem cell therapy for cardiovascular diseases［J］.Texas Heart Institute Journal，2009，36（2）：145－147.

［13］LEE J W，FANG X H，GUPTA N，et al.Allogeneic human mesenchymal stem cells for treatment of E.coli endotoxin－induced acute lung injury in the ex vivo perfused human lung［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America，2009，106（38）：16357－16362.

［14］LEE H，BAE J S，JIN H K.Human umbilical cord blood－derived mesenchymal stem cells improve neurological abnormalities of Niemann－Pick type C mouse by modulation of neuroinflammatory condition［J］.The Journal of Veterinary Medical Science，2010，72（6）：709－717.