盐酸利多卡因眼用凝胶在兔眼房水中药物浓度测定及药动学研究

刘冰，徐晓文，林宏达，孙成龙，丁黎*，尤淋君

中国药科大学 1药物分析教研室；2新药安全评价研究中心，南京 210009

盐酸利多卡因眼用凝胶在兔眼房水中药物浓度测定及药动学研究

刘冰1，徐晓文1，林宏达1，孙成龙1，丁黎1*，尤淋君2

中国药科大学1药物分析教研室；2新药安全评价研究中心，南京 210009

目的：建立兔眼房水中利多卡因的LC-MS/MS检测方法，研究盐酸利多卡因眼用凝胶在兔眼房水中的药动学特征。方法：72只雄性新西兰兔分成Ⅰ和Ⅱ两组，每组36只，Ⅰ和Ⅱ组分别给予盐酸利多卡因眼用凝胶受试制剂和参比制剂，左右眼均滴入15 μL，于不同时间点取房水样品，经沉淀蛋白后，采用LC-MS/MS法测定房水中的利多卡因。以来曲唑为内标，采用Hanbon Hedera ODS-2 C18（2.1 mm×150 mm，5 μm）色谱柱，流动相为甲醇-20 mmol·L-1醋酸铵水溶液（含0.1%甲酸）（55∶45，v/v），质谱采用气动辅助电喷雾离子化和正离子多重反应监测。结果：利多卡因房水浓度在2.070～10350 ng·mL-1范围内线性关系良好（r=0.9995）。单次给予新西兰兔受试制剂和参比制剂后，房水中利多卡因的Cmax分别为（10193±4535）ng·mL-1和（11046± 2734）ng·mL-1，AUC0-8分别为7582 ng·h·mL-1和8125 ng·h·mL-1，t1/2分别为2.6 h和1.9 h，Tmax均为0.3 h。结论：盐酸利多卡因眼用凝胶受试和参比制剂在房水中药动学特征一致，眼部给药后利多卡因可快速穿透角膜到达房水，并在房水中达到较高的浓度。

利多卡因；眼用凝胶；房水；药代动力学；新西兰兔；LC-MS/MS

盐酸利多卡因是一种酰胺类局部麻醉药，被广泛用于浸润麻醉、硬膜外麻醉、表面麻醉及神经传导阻滞。国内眼科手术多使用2%盐酸利多卡因注射液，目前尚未见专为眼表面麻醉设计的盐酸利多卡因滴眼液或其他剂型。盐酸利多卡因眼用凝胶可延长药物与眼表面接触时间，改善麻醉效果，减少药物全身吸收，因此用于眼科操作表面麻醉安全、有效[1-2]。然而，关于盐酸利多卡因眼部药代动力学的研究在国内外文献中尚未报道过，为研究盐酸利多卡因眼用凝胶的眼部药代动力学特征，本试验建立了LC-MS/MS法测定兔眼房水中利多卡因的浓度。

文献报道检测利多卡因浓度的方法为HPLC法[3]、高效毛细管电泳法[4]、气相色谱-质谱法[5]，这些方法灵敏度不高，难以满足微量浓度的检测。有文献报道采用LC-MS/MS法测定利多卡因[6-7]，但样品处理常用液液萃取，过程相对复杂。本试验建立的LC-MS/MS法简化了样品的前处理过程，灵敏度高，重现性好，符合生物样品的分析要求。

1 材料

1.1 仪器

Agilent Technologies 6410 Triple Quad LC/MS系统和MassHunter Workstation Software工作站（美国Agilent公司）；Satorious电子分析天平（德国赛多利斯股份有限公司）；HC-2062型台式高速离心机（安徽中科中佳科学仪器有限公司）；CM-1000高速振荡机（日本东京理化器械株式会社）。

1.2 药品与试剂

盐酸利多卡因眼用凝胶（受试制剂，济南百诺医药科技开发有限公司，批号：20131001，规格：5 mL∶0.175 g）；盐酸利多卡因眼用凝胶（参比制剂，AktenTM，Akorn Inc，批号：421213，规格：35 mg·mL-1）；利多卡因对照品（中国食品药品检定研究院，批号：100342-201003，纯度99.9%）；来曲唑对照品（中国食品药品检定研究院，批号：101045-201101，纯度100.0%）；甲醇、乙腈（色谱纯，美国Merck公司）；其余试剂为市售分析纯；实验用水为纯净水。

1.3 实验动物

选择72只健康新西兰兔，体重2.0～2.5 kg，均为雄兔，无眼疾，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供，动物生产许可证：SCXK（苏）2012-0008。本研究的动物饲养、给药以及生物样本的采集在中国药科大学新药安全评价研究中心进行（动物使用合格证号：0022144）。

2 方法

2.1 色谱条件和质谱条件

色谱柱：Hedera ODS-2 C18（2.1 mm×150 mm，5 μm）；流动相：甲醇-20 mmol·L-1醋酸铵水溶液（含0.1%甲酸）55∶45；流速：0.3 mL·min-1；柱温：35℃；进样量：5 μL。

离子检测方式：多重反应监测（MRM）；离子极性：正离子（Positive）；离子化方式：电喷雾离子化（ESI）；用于定量分析的离子分别为：利多卡因m/z 235.1→86.1和内标（来曲唑）m/z 286.2→217.1；传输区电压：115 V和115 V；碰撞能量：15 eV和8 eV；干燥气温度：350℃；干燥气流速：10 L·min-1；雾化室压力：40 psi。

2.2 样品的采集与处理

将72只雄性新西兰兔随机分成Ⅰ组和Ⅱ组，每组各36只，再将每组内的36只动物随机分成12组，每组3只（6只眼睛），每组对应一个采样时间点。给药前均需禁食12～24 h，Ⅰ组给予受试制剂，Ⅱ组给予参比制剂，左右眼均滴入15 μL药液，分别于给药前及给药后5、10、20、40 min，1、1.5、2、3、4、6、8 h用头皮针刺穿角膜，抽取约200 μL房水，于-20℃冰箱中密封保存。

取20 μL房水样品，加入内标（来曲唑）溶液20 μL（15.48 μg·mL-1），涡旋混匀，再加入1 mL流动相（甲醇∶水=50∶50），涡旋3 min，于15600 r·min-1高速离心5 min，取上清液5 μL进行LC-MS/MS分析。

2.3 数据处理

通过计算房水在同一采样时间点的所有样本浓度的平均值，得平均药物浓度-时间数据，采用DAS 2.0软件估算房水中利多卡因的主要药动学参数。

3 结果

3.1 分析方法验证

3.1.1 方法专属性在“2.1”项下的色谱和质谱条件下，利多卡因的保留时间为1.8 min左右，内标（来曲唑）的保留时间为3.0 min左右。由图1可见，利多卡因和内标峰形良好，房水中内源性物质不干扰测定。

图1 专属性色谱图

3.1.2 标准曲线取1.5 mL塑料离心管数支，分别精密加入利多卡因标准溶液，以氮气流吹干，加入空白房水20 μL，涡旋混匀，配成含利多卡因的浓度为2.070、6.210、20.70、62.10、207.0、621.0、2070、6210、10350 ng·mL-1的标准含药房水，按“2.2”项下方法处理，进样，记录色谱图。计算利多卡因峰面积As和内标峰面积Ai的比值f（As/Ai），以f对药物浓度C作权重回归计算，权重系数w=1/C2，得回归方程，典型的利多卡因权重回归方程为：f=0.002357×C+ 0.001363，r2=0.9995。结果显示，房水中利多卡因浓度在2.070～10350 ng·mL-1范围内线性关系良好，最低定量限为2.070 ng·mL-1，信噪比大于10。

3.1.3 精密度和准确度依“3.1.2”方法配制含利多卡因浓度分别为2.070、4.140、310.5、8280 ng·mL-1的标准含药房水，每个浓度平行5份，并制备随行标准曲线，按“2.2”项下方法处理，进行测定，连续测定3批。将所测结果进行单因素方差分析，计算精密度（RSD）和准确度，结果见表1。本方法的准确度与精密度符合生物样品分析要求。

3.1.4 基质效应和提取回收率依文献方法[8-9]考察低、中、高3种浓度（含利多卡因的浓度为4.140、310.5、8280 ng·mL-1）的基质效应和提取回收率，结果见表1。房水中内标来曲唑的回收率为（100.6± 1.4）%（n=15），基质效应为（98.2±3.0）%（n=18）。结果表明，本实验条件下利多卡因和内标的回收率均良好，房水基质对其离子化无影响。

表1 精密度、准确度、回收率（n=5）和基质效应（n=6）试验结果

3.1.5 稳定性试验以4.140、310.5、8280 ng·mL-13种浓度考察利多卡因标准含药房水的稳定性。结果显示，利多卡因房水样品在室温下放置16.5 h，反复3次冻融及-20℃冰冻21天条件下均稳定性良好；房水样品处理后的上清液在进样器中放置18 h稳定性良好。

3.1.6 稀释准确度试验依“3.1.2”项配制含利多卡因浓度分别为11154、20280 ng·mL-1的标准含药房水，每个浓度平行5份，在上述配制好的含药房水中加入空白房水稀释5倍，按“2.2”项下方法处理后测定，计算准确度，浓度为11154、20280 ng·mL-1的标准含药房水稀释5倍后的准确度分别为（93.3± 1.5）%和（100.4±0.8）%，表明稀释准确度良好。

3.2 药代动力学研究

新西兰兔眼部（左右眼均给药）分别给予15 μL（35 mg·mL-1）受试制剂和参比制剂后，计算房水在同一采样时间点的所有样本浓度的平均值，得平均药物浓度-时间数据，由此估算房水中利多卡因的主要药代动力学参数，结果见表2、图2。比较受试和参比制剂在新西兰兔房水中的药动学参数，结果表明，两制剂在新西兰兔房水中的主要药动学参数AUC0-8、AUC0-∞、Cmax、t1/2、Tmax、MRT0-8、CL、Vd基本一致，因此可以判定：两制剂在新西兰兔房水中的药动学特征是一致的。

4 讨论

本试验所建立的LC-MS/MS法样品预处理简单，灵敏度高，快速，重现性、专属性好，能适用于新西兰兔给予盐酸利多卡因眼用凝胶后房水中药代动力学的研究。

利多卡因结构中含有酰胺基团和叔胺基，呈碱性，在流动相中加入适当的添加剂可以改变待测物的保留时间，改善峰形。试验比较了水相中加酸与不加酸条件下，待测物的色谱行为：不加酸情况下，待测物保留较强，出峰时间在9 min左右，且峰拖尾严重；加酸条件下，待测物保留减弱，出峰时间仅1.8 min，且峰形对称，响应增大。原因可能是利多卡因易与色谱柱上残存的硅醇基产生作用，从而导致保留增强，峰形拖尾。加酸可以抑制硅醇基的电离，对碱性化合物的保留和峰形均能起到改善作用。同时，试验还比较了水相中加入甲酸和乙酸条件下，待测物的色谱行为。不同的酸对利多卡因在色谱柱上的保留无影响，但甲酸可使峰形更为尖锐对称。加入醋酸铵可以稳定水相的pH，对峰形也具有改善作用[10]。

表2 新西兰兔眼部分别给予15 μL（35 mg·mL-1）受试制剂和参比制剂后房水中利多卡因的药代动力学参数（n=6）

图2 新西兰兔眼部分别给予受试和参比制剂后房水中利多卡因平均浓度-时间曲线（n=6）

兔为眼用制剂研究的首选动物，兔眼与人眼大小、结构相近，因此选用新西兰兔作为眼部药动学的试验对象。房水能够较客观地反映药物在眼内的浓度变化，且在提取时一般能够准确定量，由实验操作产生的误差较小，故本试验选房水作为眼部药动学研究的考察样品[11-13]。

盐酸利多卡因眼用凝胶说明书中的人用推荐剂量是2滴（100 μL），通过剂量换算，确定本试验的给药剂量为15 μL，因此其药动学参数可以为临床用药提供参考依据。

新西兰兔眼部给予盐酸利多卡因眼用凝胶后，5 min即可在房水中测得利多卡因，8 h仍可检测得到，且在兔眼房水中药物浓度较高。结果表明，盐酸利多卡因眼用凝胶易被眼组织迅速吸收，且维持时间较长，在兔眼房水中具有良好的药动学特征和组织通透性，适合用于眼科操作的表面麻醉，值得临床推广应用。

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Determination and Pharmacokinetics of Lidocaine in Aqueous Humor after Ocular Administration of Lidocaine Hydrochloride Ophthalmic Gel to Rabbits

LIU Bing1,XU Xiao-wen1,LIN Hong-da1,SUN Cheng-long1,DING Li1*,YOU Lin-jun2
1Department of Pharmaceutical Analysis;2Centre for New Drug Safety Evaluation and Research,China Pharmaceutical University,Nanjing 210009,China

Objective：To establish an LC-MS/MS method for the determination of lidocaine in ocular aqueous humor of rabbit and to study the pharmacokinetics of lidocaine hydrochloride ophthalmic gel after a single topical ocular administration.Methods：Seventy-two rabbits were placed in two groups based on the test and reference formulations.Rabbits in each group were instilled with a single 15 μL of lidocaine hydrochloride ophthalmic gel into each eye.Following the sample collection and deproteinization procedures, the lidocaine concentrations in aqueous humor were determined by LC-MS/MS.Letrozole was used as the internal standard and the chromatographic separation was achieved on a Hedara ODS-2 column(5 μm,150 mm×2.1 mm i.d.)with a mobile phase of methanol-0.1%formic acid water solution with 20 mmol·L-1ammonium acetate(55∶45,V/V).The detection was performed using the electrospray ionization(ESI)operating in the positive ion multiple reaction monitoring(MRM)mode.Results：The method demonstrated good linearity ranged from 2.070 to 10350 ng·mL-1with r=0.9995.After administration of the test and reference formulation to the rabbits,the Cmaxvalues were(10193±4535)ng·mL-1and(11046±2734)ng·mL-1,respectively,the AUC0-8values were 7582 ng·h·mL-1and 8125 ng·h·mL-1,respectively,the t1/2values were 2.6 h and 1.9 h, respectively,and the Tmax values were both 0.3 h.Conclusion：There was no significant difference of pharmacokinetic characteristics between the two formulations.Lidocaine hydrochloride ophthalmic gel could rapidly achieve a high concentration in aqueous humor after its topical ocular administration to rabbits.

Lidocaine;Ophthalmic gel;Aqueous humor;Pharmacokinetics;New Zealand rabbits;LCMS/MS

R969.1

A

1673-7806（2014）03-201-04

刘冰，女，硕士生 E-mail:liubing19881027@163.com

*通讯作者 丁黎，男，博士生导师、教授 Tel:025-83271485

E-mail:dinglidl@sina.com

2014-03-18

2014-04-09