半夏厚朴汤抗抑郁作用——改善脑内氧化应激水平*

马占强，李瑞鹏，李月碧，傅强，瞿融，马世平**

1中国药科大学中药学院中药药理教研室，南京 211198；2南京中医药大学方剂教研室，南京 210046

半夏厚朴汤抗抑郁作用
——改善脑内氧化应激水平*

马占强1，李瑞鹏1，李月碧1，傅强1，瞿融2，马世平1**

1中国药科大学中药学院中药药理教研室，南京 211198；2南京中医药大学方剂教研室，南京 210046

目的：通过观察半夏厚朴汤对慢性应激抑郁模型大鼠行为学和氧化应激的影响，研究半夏厚朴汤抗抑郁的机制。方法：采用强迫游泳实验、开野实验、糖水偏好实验，研究半夏厚朴汤对慢性应激抑郁模型大鼠的抗抑郁作用，并通过UPLC-T-QMS系统检测其大鼠脑内单胺类神经递质的含量，部分动物取其海马制备海马匀浆，Western blotting检测超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）。结果：与空白组相比，模型组大鼠糖水消耗量显著下降，强迫游泳不动时间显著延长，交叉次数、直立次数显著减少；海马内去甲肾上腺素、5-羟色胺含量显著降低。与模型组相比，半夏厚朴汤组糖水消耗量显著升高，强迫游泳不动时间显著缩短。半夏厚朴汤组显著增加大鼠脑内去甲肾上腺素和5-羟色胺含量。Western blotting检测结果显示，与模型组比较，半夏厚朴汤组显著升高SOD水平，显著降低MDA水平。结论：半夏厚朴汤能明显改善慢性应激所致的大鼠抑郁行为，其机制可能与上调海马内去甲肾上腺素、5-羟色胺水平，增强机体抗氧化应激能力有关。

半夏厚朴汤；抗抑郁；神经递质；氧化应激

抑郁症（depression）是一种以心境障碍为主要特征的综合征，呈慢性、反复性发作，通常表现为：情绪低落、思维迟缓、运动抑制、食欲和睡眠障碍、悲观厌世以及言语动作减少，严重者甚至会出现自杀等极端自残的念头。其发病率正在快速攀升，预计到2020年时抑郁症可能成为仅次于缺血性心脏病的第二大疾病，其对患者及其家属造成的痛苦、对社会造成的损失是其他疾病所无法比拟的[1-2]。半夏厚朴汤出自《金匮要略》，其方药组成为：半夏、厚朴、茯苓、生姜、苏叶。该方为治疗情志不畅、痰气互结所致的梅核气（慢性咽炎）之常用方。本实验室前期运用多种动物行为学模型证明半夏厚朴汤具有抗抑郁作用[3-4]。为进一步探究其作用机理，本实验采用慢性不可预知应激方法建立大鼠抑郁模型，观察半夏厚朴汤对应激大鼠行为学、氧化应激的影响。

1 材料

1.1 仪器

电子天平（北京赛多利斯天平有限公司，十万分之一）；开野实验箱（直径30 cm，高20 cm）；UPLC Acquity TM系统（Waters公司）；Synapt TM TQ质谱仪（Waters公司），配有Lock-spray接口，电喷雾离子源（ESI）；Masslynx 4.1质谱工作站软件（Waters公司）；紫外凝胶成像系统、琼脂糖水平电泳仪（BIO-RAD公司，美国）。

1.2 药物与试剂

半夏厚朴汤方中药材半夏、厚朴、茯苓、生姜、苏叶等购自南京益丰大药房，并经中国药科大学中药资源学教研室秦民坚教授鉴定，药材均符合《中国药典》规定。将半夏厚朴汤各药材按《金匮要略》原方比例配伍，装入大圆底烧瓶中浸泡2 h，加8倍水加热煮沸30 min，取出药汁，再加入8倍水加热煮沸30 min，过滤药渣；取两次药汁合并蒸干后保存备用，计算浸膏得率为14.7%，使用时配制成所需浓度。盐酸氟西汀（常州四药制药有限公司，规格：10 mg，批号：201107181）；抗体SOD（CST，2770S）；MDA（CST，5321S）；lumiGLO试剂（Cell Signaling，Beverly，MA）；其他试剂为国产分析纯。

1.3 动物

清洁级SD大鼠，雄性，体重180～220 g，浙江省实验动物中心，合格证号：SCXK（浙）2008-0033，饲养环境：中国药科大学中药药理实验室，动物分笼饲养，保持昼夜节律，室温，自由饮水摄食。

2 方法

2.1 造模与给药

参照文献方法[5]。取雄性SD大鼠60只，按体重随机分组为6组，分别为：空白组、模型组、氟西汀对照组、半夏厚朴汤低、中、高（浓度）6组。每组10只，置于单独的鼠笼里，除常规空白组外其余5组给予连续3周的慢性不可预知性刺激：每天选取3～4个应激因子，避免重复，持续21 d。选用的应激因子包括：禁食（12 h）、禁水（12 h）、倾斜饲养（45°，12 h）、湿笼（洒100 mL水在垫料上）、持续光照（24 h）、噪音刺激（5 min）、摇晃鼠笼（5 min）、夹尾（距尾根1cm处夹闭1 min）。慢性刺激后，进行给药，每日给药一次，连续给药3周，各组均按1 mL/100 g的剂量灌胃，空白组和模型组给纯净水，氟西汀对照组给0.01 g·kg-1，半夏厚朴汤低、中、高组分别给3、6、12 g·kg-1，给药期间继续造模。

2.2 行为学观察

2.2.1 糖水消耗实验给药结束的第3天，分别测定各组大鼠的糖水消耗量（sucrose intake）。开始测量前禁水、禁食24 h，然后给予1%（w/v）的蔗糖水溶液，蔗糖水溶液分别置于2个相同的饮水瓶中，24 h后进行糖水消耗量的测定。测量时大鼠单独饲养，每笼1只，2个饮水瓶中分别装有普通饮用水和1%蔗糖水溶液，24 h后称量大鼠在普通饮用水、1%蔗糖水以及总液体的消耗量。比较正常大鼠、慢性应激大鼠和给予半夏厚朴汤和盐酸氟西汀的大鼠在糖水消耗及糖水偏爱方面的差异。糖水偏爱（sucrose preference，SP）以蔗糖水溶液的消耗量（g）/总液体的消耗量（g）×100%表示。

2.2.2 强迫游泳实验各组大鼠在给药结束的第4天进行强迫游泳实验。参照Porsolt等[6]方法，将大鼠置于水深30 cm、水温25°C的玻璃圆筒中，观察6 min，比较各组大鼠在后4 min内的累计不动时间。不动时间判定：大鼠漂浮在水面，不努力爬出圆筒，仅做一些必须保持其头部在水面的动作。

2.2.3 开野实验于给药结束的第2天用开野实验装置测定各组大鼠行为学的改变。参照Archer J等方法[7]，实验装置为直径150 cm、高50 cm的圆筒，在安静的环境下进行此项实验观察，观察指标：以动物穿越底面格子（行走路线与格子交叉点数）为水平活动的次数，直立（两前肢离地1 cm以上或攀附墙壁的次数）为垂直活动次数，并测定洗脸次数。将大鼠置于中心格子内适应2 min后，记录4 min内大鼠自发活动。

2.3 大脑海马组织神经递质含量测定

测定样本处理：大鼠直接断头，在冰台上迅速取出脑组织，立即投入液氮中，精确称重，每1 g脑组织加4 mL冰冷的甲醇液，于冰浴下快速玻璃棒搅拌匀浆。精密吸取1 mL匀浆液，4℃条件下14000 r·min-1离心20 min，取上清液真空冷冻干燥，残留物用700 μL水溶解，涡漩振荡10 s，加入氯仿-异丙醇（100∶30）混合液300 μL，涡漩振荡2 min，离心（3000 r·min-1）5 min，取上层水相10 μL进样（LC）[8]。

2.4 Western blotting检测大鼠海马内超氧化物歧化酶（SOD）和丙二醛（MDA）

制备大鼠海马蛋白样品，用于SOD和MDA Western blot分析。采用Bradford法测定大鼠海马样品蛋白浓度（建成生物技术有限公司，中国南京），牛血清蛋白作为标准品。蛋白（上样量为75 μg）经10%SDS-PAGE电泳分离后，将蛋白转移到PVDF膜上（孔径为0.45 μm，Pall，USA），然后在5%脱脂奶粉中封闭2 h，在不同的一抗中4℃孵育过夜。PVDF膜经0.5%TBS-T溶液洗膜3次，每次5 min。再与HRP标记的二抗进行反应，再用0.5% TBS-T溶液洗膜3次，每次5 min。最终膜用lumiGLO试剂孵育，然后用X光片显出条带，采用分析软件（Bio-Rad Laboratories，Hercules，CA）进行灰度值分析，计算目的蛋白与β-actin的灰度比值。所用一抗包括兔多克隆抗SOD（稀释比例为1∶1000）、MDA（1∶1000）。

2.5 统计学处理

3 结果

3.1 强迫游泳实验

结果见表1。与空白组相比，模型组大鼠的强迫游泳不动时间显著增加；与模型组相比，半夏厚朴汤中、高剂量和氟西汀均能显著缩短大鼠强迫游泳不动时间。

表1 半夏厚朴汤对慢性应激抑郁大鼠糖水偏好率、强迫游泳不动时间、开野实验结果的影响（±s，n=6）

表1 半夏厚朴汤对慢性应激抑郁大鼠糖水偏好率、强迫游泳不动时间、开野实验结果的影响（±s，n=6）

注：与空白组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

开野实验组别剂量（g·kg-1）糖水偏好率（%）强迫游泳不动时间（s）穿格次数直立次数空白82.6±10.3132.9±27.481.5±27.111.5±2.8模型55.7±12.1##194.7±30.3##33.9±17.8##4.1±2.0##盐酸氟西汀0.0175.8±11.9**140.0±32.7**67.4±22.3**8.8±2.6**366.3±13.6178.3±31.453.9±28.35.9±2.1半夏厚朴汤671.3±14.2*165.9±28.4*57.5±21.4*7.5±2.7*1274.3±15.3*147.6±26.9**61.5±27.2*7.9±1.9**

3.2 糖水偏好实验

结果见表1。与空白组大鼠比较，模型组大鼠糖水偏好率明显降低；与模型组相比，半夏厚朴汤中、高剂量与盐酸氟西汀显著升高大鼠糖水偏好率。

3.3 开野实验

结果见表1。与空白组大鼠比较，模型组大鼠自发活动能力明显降低，表现为穿格次数、直立次数明显减少；给予半夏厚朴汤后，与模型组相比，半夏厚朴汤中、高剂量组大鼠的穿格次数、直立次数显著增加。

3.4 大鼠海马组织神经递质含量

与空白组相比，模型组5-HT和NE含量均显著减少。与模型组相比，盐酸氟西汀组与半夏厚朴汤低、中、高剂量组5-HT、NE含量均显著增加。见表2。

表2 半夏厚朴汤对慢性应激抑郁大鼠海马组织神经递质含量的影响（±s，n=10）

表2 半夏厚朴汤对慢性应激抑郁大鼠海马组织神经递质含量的影响（±s，n=10）

注：与空白组比较，##P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别剂量（g·kg-1）5-HT（ng·mL-1）NE（ng·mL-1）空白-167.8±10.6196.3±9.2**模型-109.8±8.3##135.4±10.4##盐酸氟西汀0.01157.4±11.9**177.4±8.2**3129.5±9.9*152.0±8.3**半夏厚朴汤6138.1±7.0**160.7±12.4**12149.2±7.2**170.5±8.8**

3.5 大鼠海马内超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）含量

与空白组相比，模型组SOD表达显著减少，MDA表达显著增加；与模型组相比，盐酸氟西汀组SOD表达显著增加，MDA表达显著减少，半夏厚朴汤低、中、高剂量组SOD表达显著增加，MDA表达显著减少。见图1。

4 讨论

图1 大鼠海马内超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）的表达

抑郁症发病机制复杂，慢性不可预见性应激经典模型常用于抑郁症的病理生理机制和抗抑郁药物作用机制的研究[9]。糖水偏好测定、强迫游泳实验、开野实验均模拟了抑郁症患者的快感缺乏、兴趣缺失、精神运动迟滞等抑郁表现。而半夏厚朴汤在糖水偏好实验中能明显增加大鼠的糖水偏好率；在开野实验中能增加大鼠的自主活动与探究能力；在强迫游泳实验中能减少强迫游泳大鼠的不动时间。诸此，证明了半夏厚朴汤的抗抑郁作用。

在抑郁症的发病机制研究中，脑内单胺类神经递质假说占有重要地位，尤其与去甲肾上腺素、5-HT和多巴胺等这类大脑原有的，用来协助神经元间信息传导的物质有关[10]。本研究通过UPLC-TQMS系统，对慢性应激抑郁模型大鼠的海马区单胺类递质含量进行检测，结果显示，半夏厚朴汤能提高大鼠脑内去甲肾上腺素、5-HT递质含量。半夏厚朴汤的抗抑郁作用机制与提高大鼠脑内神经递质含量相关。

已有研究报道，抑郁症的发生与氧化应激损伤关系密切[11-12]。抑郁症是慢性的心理及生理应激过程，可引起体内神经内分泌系统的功能变化，并伴有氧化应激系统的激活，引起中枢神经系统的氧化损伤。临床研究发现，重度抑郁症患者体内SOD的活性降低，而MDA的含量升高[13]，给予清除自由基的药物，能改善大鼠的抑郁症状。本实验结果显示，慢性抑郁模型大鼠大脑海马MDA含量显著升高，而SOD活性显著降低，提示大鼠脑内氧化应激系统失衡，并出现脂质过氧化损伤；半夏厚朴汤低、中、高剂量组可显著改善慢性抑郁模型大鼠抑郁症状，提高机体的抗氧化应激能力，减轻脂质过氧化损伤。

综上所述，本实验结果表明，半夏厚朴汤的抗抑郁作用机制除普遍认为可调节抑郁动物脑内单胺类水平之外，还可能与清除脑部自由基、提高脑部抗氧化酶的活性有关。

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[4] 傅强，马世平，瞿融.半夏厚朴汤抗抑郁作用研究-Ⅱ对未预知的长期应激刺激抑郁模型的作用[J].中国天然药物，2005，3（2）：112-5.

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Antidepressant-like Effects of Banxia Houpu Decoction by Improving the State of Oxidative Stress in the Brain*

MA Zhan-qiang1,LI Rui-peng1,LI Yue-bi1,FU Qiang1,QU Rong2,MA Shi-ping1**
1Department of Pharmacology for Chinese Materia Medica,School of Traditional Chinese Pharmacy,China Pharmaceutical University,Nanjing 211198,China;2Discipline of Chinese and Western Integrative Medicine, Nanjing University of Chinese Medicine,Nanjing 210046,China

Objective：To study the anti-depression mechanism of Banxia Houpu Decoction.Methods：Rat models were established by chronic unpredictable mild stress(CUMS),sucrose consumption,open-field and forced swimming tests were used to observe the behavior of the model rats.UPLC-T-QMS was used to analyze the levels of monoamine neurotransmitters.Western blotting detected the levels of superoxide dismutase(SOD)and malondialdehyde(MDA)in brain.Results：Compared with the normal group,the frequency of crossing and standing and the consumption of sucrose water in the depressive disorder rats decreased significantly,the duration of immobility in forced swimming test increased significantly,the contents of 5-HT and NA reduced.Compared with the model group,the frequency of crossing and standing and the consumption of sucrose water in the Banxia Houpu Decoction group rats increased significantly,the duration of immobility in forced swimming test decreased significantly.Western blotting analysis showed that, compared with the model group,Banxia Houpu Decoction could significantly elevate the levels of SOD,and significantly reduce the levels of MDA in hippocampus.Conclusion：Banxia Houpu Decoction improved the depression syndromes of rats induced by CUMS,of which the mechanism involved the upregulation of 5-HT and NE levels and enhancement of anti-oxidative stress ability.

Banxia Houpu Decoction;Anti-depression;Neurotransmitter;Oxidative stress

R965.1

A

1673-7806（2014）03-205-04

江苏省自然科学基金面上项目资助（BK2011630）；中央高校基本科研业务费专项资金资助（JKQ2011036）；江苏高校优势学科建设工程项目（PAPD）；江苏省普通高校研究生科研创新计划（CXZZ13_03）

马占强，男，博士生 E-mail:mazhanqiang0427@163.com

**通讯作者 马世平，男，教授，博士生导师 E-mail:spma@cpu.edu.cn

2014-03-20

2014-03-31