电子鼻在芒果采后病原菌种类判别中的应用研究

李敏 胡美姣 张正科 梁秋南 杨冬平 陈亮 郑淑英 高兆银

摘 要 利用电子鼻对胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）、可可球二孢（Botryodiplodia theobromae Pat.）、芒果小穴壳（Dothiorella dominicana Pet. et Cif.）和芒果拟茎点霉（Phomopsis mangiferae Ahmad.）4种芒果采后病害病原菌发酵液的挥发性气味进行检测，以评估电子鼻用于芒果不同真菌病原菌种类判别的可行性。结果表明，对气味响应值进行的主成分分析（PCA）、线性判别分析（LDA）及聚类分析均能够正确区分不同病原菌种类。多因素方差分析（MANOVA）结果显示，不同病原菌之间的差异显著（p<0.05）。结果为芒果采后病原菌种类判别提供新的方法，为其他病原菌的种类判别提供参考。

关键词 芒果；电子鼻；病原菌；主成分分析；线性判别分析；聚类分析；多因素方差分析

中图分类号 S667.7 文献标识码 A

通常病原真菌的种类鉴定以观察其形态学特征为主，另外可通过病菌rDNA-ITS序列对比分析做进一步验证。然而利用形态学进行种类判断时，常出现因培养条件不适合或培养时间短，造成病菌产孢结构和孢子缺失现象，给鉴定工作带来一定的困难和限制。利用对比rDNA-ITS序列等分子生物学手段进行辅助验证也需要一定周期。然而有研究发现，真菌可以释放出多种挥发性有机化合物（VOC）[1-2]，GC-MS分析表明其包含如单萜，倍半萜，醇类、醛、芳香族化合物，碳氢化合物，酯，酮，呋喃，氮和含硫化合物等[3-5]。而电子鼻可以分析、识别和检测复杂嗅味及大多数挥发性成份。其通常由若干气敏传感器组成传感器阵列进行气体挥发性物质的复合检测和识别，阵列中每一个传感器对某些特定种类的气体成分敏感，使得整个电子鼻能够对气体中不同的成分进行识别并给出总体评价。目前已广泛用于农畜产品的品质检测和分级。在水果成熟度监控、货架期判断、水果种类鉴定等方面均有一定的应用价值[6-8]。有研究结果表明，电子鼻技术能够对蓝莓[9]和草莓[10]是否早期感染病害做出较准确的判断。胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.）、可可球二孢（Botryodiplodia theobromae Pat.）、芒果小穴壳（Dothiorella dominicana Pet. et Cif.）和芒果拟茎点霉（Phomopsis mangiferae Ahmad.）[11]是芒果采后病害主要病原菌，本研究拟以芒果采后病害主要病原菌为研究对象，应用电子鼻测定这4种病原菌发酵液的气味响应值，通过主成分分析、线性判别式分析等方法探讨基于电子鼻区分不同芒果采后病原菌的可行性，为芒果采后病原菌种类判断提供有效的辅助手段。

1 材料与方法

1.1 病原菌

芒果采后常见4种病原真菌：胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides Penz.，CG）（3株菌株，编号分别为CG1、CG2、CG3）、可可球二孢（Botryodiplodia theobromae Pat.，BT）（3株菌株，编号BT1、BT2、BT3）、芒果小穴壳（Dothiorella dominicana Pet. et Cif.，DD）（3株菌株，编号DD1、DD2、DD3）和芒果拟茎点霉（Phomopsis mangiferae Ahmad.，PM）（3株菌株，编号PM1、PM2、PM3），均由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所采后病害及贮运保鲜实验室分离、鉴定、保存。

1.2 传感器响应值测定

将12株菌株分别置于PDA培养基28 ℃培养 5 d后，取6块病菌菌饼（Φ=5 mm）接种到含100 mL PDB培养基的三角瓶中，置于28 ℃，150 r/min振荡培养3 d。再应用德国AIRSENSE公司PEN3便携式电子鼻获取菌株发酵液气味的响应值。电子鼻传感器阵列包含10个传感器（见表1）。测定时，传感器涂层吸附样品中的挥发性物质产生电导率变化，记录传感器吸附样品挥发物后的电导率G与传感器吸附经活性碳过滤的空气后的电导率G0的比值G/G0（即相对电导率），响应气体浓度越大，G/G0的值越偏离1，如果浓度低于检测限或者没有感应气体，则该比值接近甚至等于1。

1.3 传感器响应值数据处理

采用电子鼻自带的 Winmuster 软件进行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）、线性判别分析（Linear Discriminant Analysis，LDA）、载荷分析（loading Analysis）。利用软件SPSS进行多因素方差分析、聚类分析。

2 结果与分析

2.1 主成分分析（PCA）

利用48、49、50 s时的响应值进行主成分分析（PCA），结果表明，第一主成分（PC1）区分贡献率为98.98%，区分贡献率大于90%，表明第一主成分已经基本代表了样品的主要信息特征（图1）。第二主成分（PC2）区分贡献率仅为0.63%，但在区分不同病菌种类中起重要作用。通过PCA分析发现，相同的病原菌分别聚在相近的位置，从而可以将4种病原菌较好的区分开来。其中B. theobromae和其它3种病菌的距离最远，且3株B. theobromae的距离也相对较大。C. gloeosporioides、D. dominicana和P.mangiferae在第一主成分上差异较小，三者之间的区别主要体现在第二主成分上。

2.2 线性判别（LDA）分析

利用传感器第48、49、50 s时的响应值进行线性判别式（LDA）分析，结果表明， 第一判别式（LD1）的贡献率为98.95%，大于90%，已经基本代表了样品的主要信息特征（图2）。第二判别式（LD2）的贡献率仅为0.83%，但在区分不同病菌种类中起关键作用。利用线性判别式分析，可以将BT、CG、DD、PM这4种不同的病原菌很好的区分开，相同的病原菌分别落在相近的位置（图1，2），B. theobromae和其它3种病菌的区别较大，而C. gloeosporioides、D. dominicana和P.mangiferae的区别主要体现于第二判别式。

2.3 载荷（loading）分析

通过载荷分析，可以得出电子鼻的10个传感器分别对样品的PCA主成分分析的贡献率。其中S7号传感器对第一主成分区分和第二主成分区分贡献率最大。S2、S6、S8、S9号传感器对第一主成分贡献率较大；S2、S7、S8号3个传感器对应的点在第一象限中距离很近，说明这3个传感器的响应值并不是菌株挥发性气体的特征信号，S1、S3、S4、S5、S10这5个传感器对第一主成分区分和第二主成分区分贡献率均很小（图3）。

2.4 响应值方差分析

利用病原菌对电子鼻传感器第50 s的响应值进行多因素方差分析，结果如表2所示。其中 Wilks'Lambda表示组内变异与总变异的比值，在0～1之间； Wilks' Lambda值越接近1，表示各个组间的差异越小；Wilks'Lambda越接近0，表示组间差异越大。由表2可知，4种病原菌间响应值的Wilks'Lambda均接近0，说明不同病菌间有明显差异，差异水平显著（p<0.05）。

2.5 不同病原菌响应值的聚类分析

利用12株病原真菌对电子鼻传感器第50s的特征响应值，按照系统聚类的欧氏距离ward法进行系统聚类，结果表明（图4），同种的3株病原真菌分别聚成一类。不同病原菌之间关系有差别。其中C. gloeosporioides和D. dominicana的距离最近，其次是P. mangiferae；B. theobromae与其它3种病原菌的距离较远。

3 讨论与结论

真菌可以释放出多种挥发性物质[1-2]，但挥发物的气味特征和种类之间是否有相关性、是否能根据气味特征进行种类的识别等尚未见报道。本文利用电子鼻对不同芒果4种病原真菌发酵液进行气味的测定，并对10组传感器的响应值进行了PCA分析、LDA分析、方差分析和聚类分析，每种分析结果均可把同种病原菌的3株菌株划为一组，从而较好区别不同的病原菌，初步证明同种病菌的发酵液具有相似的挥发性气味，且有区别于其他病菌。聚类分析的结果表明，C. gloeosporioides和D. dominicana的距离最近，说明其发酵液气味较相近，B. theobromae与其它病原菌的气味差异较大。笔者利用Genebank上rDNA-ITS序列构建4种病原菌系统进化树的聚类结果表明，C. gloeosporioides和P.mangiferae关系较近，而B. theobromae和D. dominicana的关系较近。该结果与电子鼻传感器响应值的聚类结果有很大差异。说明供试病菌的气味差异与其亲缘关系的亲疏没有相关性。

朱娜等[10]利用电子鼻特征传感器响应值，构建了草莓感染3种霉菌类型的判别模型，判别准确率达 95%以上。本研究中由于没有足够的实验样本量，无法运用Fisher 线性判别分析等方法构建判别模型，在后期研究中，增加每种病菌的实验样本量，建立准确的病菌类型判别数学模型，从而实现利用电子鼻进行4种芒果采后病害种类的准确区分和判别。为芒果采后病原菌种类的判断提供有效的辅助手段。

参考文献

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