qRT—PCR分析莱茵衣藻氮、硫同化相关基因的表达

李平 费小雯 李兴涵 邓晓东

摘 要 实验发现，缺氮、缺硫的环境有利于莱茵衣藻油脂的积累，说明与氮、硫同化相关的基因也与油脂合成有着密切的关系。分析了氮、硫同化通路相关基因，选择氮同化相关的6个基因（NAR3、NAR1.1、NII1、NIA1、NIT2、AOX1）以及硫同化相关的6个基因（SULP1、SIR1、SLT1、ARS1、SULTR1、ATS1）进行qRT-PCR分析。对莱茵衣藻CC124以及CC425藻株分别进行缺氮、缺硫处理，Trizol法连续提取4 d的RNA作为模板，进行实时荧光定量PCR检测基因的表达水平。结果发现，这12种基因均较对照上调表达，其中，莱茵衣藻氮、硫运载体基因上调表达非常显著。缺氮条件下NAR3、NAR1.1较正常最高上调表达200倍；缺硫条件下SLT1较对照有1 000～2 000倍的mRNA表达量，SULTR2也最高能增高450倍的表达量。

关键词 莱茵衣藻；缺氮；缺硫；qRT-PCR

中图分类号 Q78 文献标识码 A

随着经济的发展和技术的进步，各国对能源的需求日益增大，而传统的化石能源日益枯竭，因此开发新的可再生能源成为当今世界各国关注的焦点[1]。同时，Zeller等[2]还研究了发展中国家生物燃料产业的前景和挑战，及其粮食安全及全球粮食价格升高带来的威胁。生物柴油作为一种新兴的可再生生物能源，清洁环保，易生物降解，燃烧后排放的氮氧化物和CO2少，且可直接用于现有的柴油发动机，是良好的化石燃料替代物[3]。其中，微藻是制取生物柴油最有希望和前途的原料，具有分布广泛、环境适应力强、生长迅速、油脂含量高等特点[4]。因此，对微藻进行深入的研究具有非常可观的应用前景。

微藻是一类在陆地、海洋分布广泛，营养丰富、光合利用度高的自养低等水生植物。在适宜条件下，微藻通常处于营养生长状态，细胞内脂质含量较低，且多为极性脂（polar lipid），如磷脂（phosphor lipid）。而在胁迫条件下，细胞内很快积累大量中性脂（neutral lipid），如甘油三脂（triacylglycerol， TAG）[5]。其中，氮素是组成氨基酸的必要成分之一，氮素的缺乏直接限制光合膜蛋白以及包括叶绿素在内的其他色素分子的合成，最终影响光合放氧能力[6]，当植物缺硫时降解植物组织中的硫库，释放硫元素，表现为总蛋白和叶绿素含量降低[7]。李亚军等[8]研究发现氮元素缺乏可诱导莱茵衣藻（Chlamydmonas reinhardtii）在细胞内大量积累三酰甘油。硫营养限制也能使微藻细胞的含油量大幅提高[9]。本研究分析氮、硫同化通路中的相关基因，意图从这些基因中找到具有重要研究价值的基因。

本实验室着重研究莱茵衣藻在能源方面的应用价值，研究发现，在缺氮、缺硫的条件下有利于油脂的积累，能够在氮、硫同化中找到与油脂合成密切相关的基因，本次实验运用实时荧光定量PCR的方法对相关基因进行初步的摸索，对以后的研究有一定的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

藻株： Chlamydomonas reinhardtii CC124和细胞壁缺陷型的Chlamydomonas reinhardtii CC425（购于美国杜克大学衣藻中心）。

主要试剂及仪器：酶标仪（BIO-TEKELx800）；实时荧光定量PCR试剂盒SYBR Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）购于TaKaRa公司；实时荧光定量PCR仪（STRATAGENE Mx3005）。

1.2 方法

1.2.1 莱茵衣藻的培养及相关生理生化指标的测定

（1）藻株生长曲线绘制及生物量测定。根据实验藻在490 nm波长下有特定的吸收值[10]，用酶标仪（BIO-TEKELx800）分别测定8瓶不同时长500 mL培养的CC425藻株在490 nm下的吸光值，并对应称取干重，根据吸光值与干重对应的关系，绘制CC425藻株干重标准曲线，得到本研究莱茵衣藻的生物量标准曲线y=0.599 4x-0.016 3[11]。

将CC124、CC425藻株分别接种于含有50 mL HSM培养基的100 mL三角瓶中，置于在25 ℃，全光照，光照强度3 000～4 500 lx的培养条件下220 r/min振荡培养3～4 d至对数生长期。将藻液进行离心、富集，用少量HSM培养基进行稀释、打匀，将CC124接入50 mL HSM、HSM-N培养基，CC425接入50 mL HSM和HSM-S的培养基中，HSM和HSM氮、硫元素缺乏培养基参照费小雯等[9]培养基的配制。通过血细胞计数法[12]在显微镜下数细胞，保证接入的藻液终浓度一致，细胞数约1×106～1×108个/mL左右，每种处理4～5瓶，于25 ℃，16 h光照（1 000～3 000 lx），8 h黑暗进行震荡培养。培养期间每24 h取样1次，使用酶标仪测量缺氮、缺硫条件下CC124和CC425藻液在490 nm处的吸光值，且每组实验设5个平行，根据生物量标准曲线得藻株每日的生物量，并绘制藻株的生长曲线。

（2）藻株增长曲线绘制及其油脂含量。利用尼罗红染色法测量油脂含量[13]首先绘制三酰甘油浓度标准曲线。在藻株培养的第48小时，取适当藻液进行离心、富集，取10 μL藻液加入0.2 μL 0.1 mg/mL尼罗红染料和1.8 μL DMSO孵育10 min，分别测量在染色前后的吸光值，且每个样设置5个平行。根据三酰甘油浓度标准曲线，计算每日的油脂含量，绘制油脂增长曲线。

（3）藻株状态及油滴观察。将以上培养的藻株在培养的2～3 d 时，对三角瓶中藻液的外观状态拍照。取10 μL的藻液制片，并加入1 μL的鲁格式碘液固定细胞，使用浓度为0.2 μL 0.1 mg/mL的尼罗红染色10 min，使用荧光显微镜进行白光和荧光对油滴进行观察和拍照[14]。

1.2.2 相关基因引物设计及Real Time PCR

（1）藻种RNA的提取及cDNA合成。参照李亚军等[8]RNA提取方法分别提取CC124和CC425第1、2、3、4天的动态RNA，并将提取的RNA进行变性和反转录，用于Real Time PCR的模板。

（2）引物的设计及合成。此次Real Time相关引物用Primer Premier5进行设计，设计的引物信息见表1[引物均为委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成]。

（3）SYBR实时定量PCR检测。以连续4 d提取出的RNA做模板和以上合成的引物，每组设3个生物学重复。使用SYBR Premix Ex Taq（TakaRa）实时荧光定量试剂盒进行动态荧光定量PCR检测，总反应体系为16 μL，SYBR Premix Ex TaqⅡ（2×）7.5 μL，ROX Reference Dye（50×）0.3 μL，PCR正向引物1 μL，PCR反向引物1 μL，模板1 μL，双蒸水5.2 μL，每组设3个平行，扩增条件为95 ℃反应1 min；95 ℃反应20 s和58 ℃反应20 s，循环40次。内参为：18S rRNA。

2 结果与分析

2.1 莱茵衣藻CC124和CC425在缺氮、缺硫条件下生理生化指标

2.1.1 藻株在缺氮、缺硫条件下生物量变化 由图1、2可以看出，缺氮、缺硫的环境均使藻株的生物量下降，培养3～4 d，两种逆境条件都使藻株生物量下降2～3倍。差异极显著（通过SPSS软件分析，p<0.01差异极显著），说明缺氮、缺硫环境对莱茵衣藻的生长抑制作用很明显。

2.1.2 藻株在缺氮、缺硫条件下油脂含量变化

在测量生物量的同时，对藻株每日的油脂含量进行测量，由图3、4可以看出，缺氮、缺硫的环境有益于莱茵衣藻CC124、CC425油脂的积累，藻株培养3～4 d，在缺氮的条件下，相对于正常培养的CC124藻株油脂量积累增加了5～10倍，缺硫处理也能导致CC425藻株油脂含量增加5～6倍，差异极显著（p<0.01）。

2.1.3 藻株在缺氮、缺硫条件下藻状态及油滴显微拍照 由图5可以看出，缺氮、缺硫的环境会导致藻液颜色变黄，其中原因之一也有可能与图1、2中藻株在缺氮、缺硫环境下生物量较少有关，并且与对照相比，油滴积累明显增多。荧光暗场照片中黄色荧光代表以三酰甘油为主的中性脂。

2.2 实时定量PCR结果

2.2.1 与氮同化相关的基因在正常与缺氮条件下mRNA的表达水平 由图6可以看出，在缺氮水平较正常条件相比，NAR3和NAR1.1这2个基因基因表达量明显上升，最高能增高200倍左右；同时，NII1基因能较高水平地增高表达量，最高能到30倍左右；NIA1、NIT2、AOX1基因低水平地提高表达量，约1～10倍之间，其中NIA1前两天其mRNA表达量较正常要低，经过3～4 d的培养之后，缺氮条件开始较正常表达量高。说明实验的这6个基因在缺氮条件下表达量均升高，并且NAR3、NAR1.1促进效果更为显著。

2.2.2 与硫同化相关的基因在正常与缺硫条件下mRNA的表达水平 由图7可以看出，在缺硫条件下较正常相比，SLT1、ARS1、SULTR2、ATS1这4个基因mRNA表达量有很明显的提高，其中SLT1增高了1 000～2 000倍，SULTR2也最高能增高450倍的表达量，ARS1、ATS1提高10～30倍，SULP1、SIR1的表达量提高了约2～5倍左右。

3 讨论与结论

根据微藻产油相关报道，氮、硫同化相关的基因可能与油脂积累有间接的关系[31]，对TAP或者HSM培养基进行缺氮和缺硫处理，会导致莱茵衣藻中三酰甘油的大量聚集。实验中的图1～5也可以看出在缺氮、缺硫的环境会导致藻液状态变黄，较正常相比，缺氮缺硫条件下的藻株油脂的积累明显增高。由此笔者对氮、硫同化通路里典型的基因进行表达研究。实验根据2-△△CT相对定量法通过计算得到目的基因相对于内参基因的表达量[32]，系统地把多个基因一起进行分析，方便快捷地得出实验结论。从图6和图7中可以直观地看出缺氮、缺硫能够促进莱茵衣藻中氮同化或硫同化相关基因的表达。在图6所示的缺氮环境中，NAR3和NAR1.1较对照mRNA表达量显著提高，最高能达200倍，在图7所示的缺硫环境中，SLT1较对照有1 000～2 000倍的mRNA表达量，SULTR2也最高能增高450倍的表达量。经过分析发现，这4个基因均分别是莱茵衣藻氮和硫的转运载体基因，说明在缺氮，缺硫的条件对相应元素转运载体基因的表达还是有着很大的影响。NAR在高等植物中受NO3-的诱导表达[33]，在N通路中发挥很重要的作用。在拟南芥缺硫状态下研究发现，高亲和性运输载体对硫的应答是受转录水平调节，尤其是在长时间的缺硫状态下，表达量明显升高[34]。运载体在植物对矿物质元素吸收的过程中作用关键，本研究只是初步对相关的基因做了定量分析，而上述基因是否真正与油脂代谢有联系，还需要通过对相关基因的缺失或过量表达进行分析，深入研究这些基因对莱茵衣藻中与油脂积累的影响才能得出结论。

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责任编辑：沈德发