红曲霉液体深层发酵生产红曲色素条件的研究

李慧 兰时乐

（1.湖南省微生物研究院,湖南长沙410009；2.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙410128）お

摘要

［目的］ 确定红曲霉产生红曲色素最适宜的培养基配方和培养条件。［方法］ 采用改变单一变量的方法，测定红色素色价的变化规律，确定红曲霉产生红色素最适宜的培养基配方和培养条件。［结果］试验确定了红曲霉产生红色素最适宜的培养基配方为:葡萄糖5%，酵母粉2%，CaCO3 0.2%,NaCl 0.1%,MgSO4·7H2O 0.1% ，KH2PO4 0.2%，吐温20 0.05%;最适宜的培养条件为：pH 6.0，装液量为60 ﹎l/250 ml三角瓶中接种10%(1/6)种龄为72 h的液体种子， 30 ℃恒温摇床上振荡培养，转速为180 r/min，发酵6 d，红曲色素色价可达19.2 U/ml。［结论］该试验可为工业上大规模生产红曲红色素提供理论依据。

关键词 红曲霉；红色素；液态发酵；发酵条件

中图分类号 SB188+.4文献标识码

A文章编号 0517-6611（2014）19-06360-04お

Study on Liquid Fermentation Conditions of 玀onascus 玃igment by 玀onascus fumeusお

LI Hui, LAN Shi瞝e (Microbiology Institute of Hunan Province, Changsha, Hunan 410009; School of Biology Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha, Hunan 410128)

Abstract［Objective］ To determine the optimal culture medium and fermentation conditions of 玀onascus 玴igment production by 玀onascus fumeus. ［Method］ By changing single variable, the variation law ofred pigment was determined, the optimal culture medium formula was determined. ［Result］ The optimal culture medium was as follows: glucose 5%, yeast powder 2%, CaCO3 0.2%, NaCl 0.1%, MgSO4·7H2O 0.1%, KH2PO4 0.2%, Tween 20 0.05%. The suitable fermentation conditions were as follows: pH 6.0, broth volume of the shake flake 60 ﹎l/250 ml, inoculation volume 10%(1/6), seed瞐ge 72 h, culture temperature 30 ℃, rotation speed 180 r/min, fermentation time 6 d, the 玀onascus 玴igment reached 19.2 U/ml. ［Conclusion］ The study can provide theoretical basis for the large scale production of 玀onascus 玴igment.

Key wordsMonascus 玈pp.; Erythrophyll; Liquid state fermentation; Fermentation conditions

お

作者简介 李慧（1969- ），女，湖北武汉人，工程师，从事微生物资源利用研究。*通讯作者，副教授，硕士，硕士生导师，从事生物工程研究。

收稿日期 20140529

最迟在1 000年以前，我国的先民就已发明了红曲［1］。红曲霉(Monascus)用途很多，我国早在明朝就利用它培制红曲，红曲可用于酿酒、制醋、做豆腐乳的着色剂，并可作食品染色剂和调味剂，还可做中药，近年来红曲霉已用于工业生产糖化酶制剂。红曲霉在欧洲一度被视为一种腐败菌，但在许多亚洲国家，特别是东南亚则被用来作为加工传统食品的微生物［2］。

红曲霉在生长过程中能产生多种酶，如淀粉酶、葡萄糖淀粉酶、糖化酶、麦芽糖酶、蛋白酶、果胶酶等，不同种类菌株产酶的类型及产量有所差异，某些菌种能分泌直接催化己酸和乙醇合成己酸乙酯的胞外酶，有的红曲霉菌株还能产较高活性的蛋白酶，故可用红曲腌渍鱼、肉、豆腐等高蛋白食品，经1～3个月的腌渍，可制出色、香、味具佳的产品。红曲中含有葡萄糖淀粉酶能将淀粉几乎百分之百地水解成葡萄糖，工业上利用红曲这一特性代替了酸水解法生产葡萄糖。

2002年我国规定,允许食品加工使用的红色食用色素主要有甜菜红、胭脂红和红曲红等［3］。在国外，甜菜红和胭脂红已经被禁止使用和限制使用［4］，而红曲红色素以粮食为原料，可通过发酵法大量生产，可以满足常年大规模生产的需要，而且红曲霉发酵产物本身具有较好的营养价值和一定的防腐作用［5-7］，具有降低血脂、降血压、抑瘤抗癌、提高人体免疫力等药用功效［8-10］，长期使用对人体有益无害。因此，目前红曲已广泛用于食品添加剂、降血脂药物及保健食品等方面［11］。

红曲霉是一种腐生真菌,它属于真菌门、子囊菌纲、真子囊菌亚纲、曲霉目、曲霉科和红曲霉属。红曲霉的利用在我国具有悠久的历史［12］，长期以来，人们对红曲霉的关注集中在其产生大量的天然红曲色素方面，并且将研究重点放在了红曲色素着色剂的生产及其在酿酒、酿醋、制成腐乳、腌渍肉类等应用方面［13］。最近几年，人们发现红曲霉在生长过程中可以产生色素、抗生菌、桔霉素等多种代谢产物，这些代谢产物有着不同的生物学活性，其中一些具有显著的医疗价值。20世纪80年代以来，国内外对具有周期发酵短、发酵过程易控制、节省原材料、色素含量高、杂质少等诸多优点的液体深层发酵法生产红曲色素进行了较为深入的研究，取得了很大的进展，发酵的色价达到了较高的水平［14-15］。

液体发酵培养法是生产红曲红色素较为理想的方法，具有工艺简单、生产周期短等优点，不过该方法色素产率低，影响推广。红曲霉产生红曲色素的培养基配方和培养条件的变化对所产生色素的种类、性质和质量会有很大影响［16-19］。因此，液体发酵法生产红色素的关键是筛选高色价的红曲霉色素的培养基配方和培养条件。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌种。红曲霉（玀onascus spp.）,湖南省微生物研究所菌种保藏中心提供。

1.1.2 培养基。

斜面培养基：马铃薯汁20%，葡萄糖2%，琼脂2%，pH自然。

种子培养基：葡萄糖5%，豆饼粉1%，氯化铵1%，CaCO3 0.2%,NaCl 0.1%,MgSO4·7H2O 0.1%，KH2PO4 0.2%，pH自然。发酵基础培养基：大米粉 8.0%，豆饼粉 2.0%，KH2PO4 0.2%, MgSO4·7H2O 0.1%,CaCO30.2%,NaCl 0.1%，pH自然。

1.1.3 主要仪器设备。SS325自动立式灭菌锅；ZD85气浴恒温振荡器，常州市华益达教学仪器有限公司；DHG9076A电热恒温鼓风干燥箱、DNP9082型恒温培养箱，上海精宏实验设备有限公司；721分光光度计，北京瑞利分析仪器公司；SW睠J1FD超净工作台。

1.1.4 主要试剂与药品。大米粉，糯米粉，淀粉，葡萄糖，蔗糖，麦芽糖，豆饼粉，酵母粉，鱼粉，蛋白胨，硫酸铵，氯化铵，KH2PO4，K2HPO4，Na2HPO4，NaH2PO4,吐温20，吐温40，吐温60，吐温80，洗衣粉，MgSO4·7H2O，CaCO3，NaCl，HCl缓冲液，NaOH缓冲液，琼脂，马铃薯，pH试纸，灯用酒精。

1.2 方法

1.2.1 培养方法。斜面培养：将接种好的斜面置于30 ℃的恒温箱内培养6 d。液体种子培养：将接种的液体种子培养基置于恒温摇床上，转速为180 r/min，于30 ℃培养48 h。液体发酵培养：在250 ml三角瓶中装入100 ml发酵培养基，按10%的接种量接种后于30 ℃、180 r/min振荡培养6 d。

1.2.2

红曲色素发酵条件的研究。通过对碳源、氮源、无机盐、表面活性剂、装液量、pH、培养温度、接种量、种龄、转速、培养时间等因素的选择来优化红曲霉红曲色素产生的条件。

1.3 红曲色素的测定

按照文献［20］提供的方法测定。将发酵液用4层纱布过滤，所得滤液稀释20倍后，用蒸馏水作为对照，在510 nm波长下测定吸光度。用吸光度乘以发酵液的稀释倍数，即为发酵液的色价（U/ml）［21］。

发酵液色价＝吸光度玂D值×稀释倍数

2 结果与分析

2.1 培养基配方对红曲霉红曲色素产量的影响

2.1.1 不同碳源对红曲色素生成的影响。改变基础培养基中碳源的种类，以大米粉、糯米粉、淀粉、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖作为碳源，加入量为8%，其他条件不变，考察不同碳源对红曲色素产生的影响。从表1可以看出，不同碳源发酵产生的红色素色价各有不同，其中以麦芽糖和葡萄糖最好，淀粉最差。主要因为淀粉成糊状，影响培养基中溶氧，不利于菌体的生长。麦芽糖比葡萄糖稍好，基于生产成本考虑，选用葡萄糖作为碳源较为适宜。

表1 碳源对红曲色素产生的影响

碳源 玂D值 色价∥U/ml

大米粉 0.20 4.00

糯米粉 0.33 6.60

淀粉 0.08 0.16

葡萄糖 0.42 8.40

蔗糖 0.22 4.40

麦芽糖 0.43 8.60

2.1.2 葡萄糖含量对红曲色素生成的影响。

在其他条件不变的条件下，以4%、5%、6%、7%、8%、9%的葡萄糖为碳源，考察葡萄糖浓度对发酵液红曲霉红曲色素色价的影响。

从表2中可以看出，葡萄糖4%～5%时，随着葡萄糖用量的增加，红曲色素色价增大，到达5%以后，随着葡萄糖用量的增加，红色素色价减小，但是速度不快，并没有明显的差异。所以，该菌种碳源的最适的量为5%。

表2 葡萄糖含量对红曲色素产生的影响

葡萄糖∥% 玂D值 色价∥U/ml

4 0.46 9.2

5 0.52 10.4

6 0.50 10.0

7 0.39 7.8

8 0.40 8.0

9 0.39 7.8

10 0.37 7.6

2.1.3 不同氮源对红曲色素生成的影响。在其他条件不变的条件下，以熟豆饼粉、酵母粉、鱼粉、蛋白胨、硫酸铵、氯化铵各2%为氮源，考察对发酵液红曲霉红曲色素色价的影响。

从表3可以看出，不同氮源发酵产生的红曲色素色价差异较大，无机氮源发酵产生红曲色素明显较有机氮源发酵产生的红曲色素色价低。当使用酵母粉为氮源时，红曲色素色价可达19.20 U/ ml。

表3 氮源对红曲色素产生的影响

氮源 玂D值 色价∥U/ml

豆饼粉 0.44 8.80

酵母粉 0.94 19.20

鱼粉 0.33 6.60

蛋白胨 0.37 7.40

硫酸铵 0.02 0.40

氯化铵 0.07 0.14

2.1.4 酵母粉含量对红曲色素生成的影响。

改变培养基中酵母粉的含量，其他条件不变，分别考察0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%、4.0%的酵母粉对红曲霉产生红曲色素的影响。

从表4可以看出，酵母粉含量0.5%～4.0%时，随着酵母粉的增加，红色素色价逐渐增大，当酵母粉含量为2.0%时，发酵液色价达17.0 U/ml，但酵母粉含量超过2.0%，发酵液色价明显降低。

表4 酵母粉含量对红曲色素产生的影响

酵母粉∥% 玂D值 色价∥U/ml

0.5 0.42 8.4

1.0 0.65 13.0

1.5 0.72 14.4

2.0 0.85 17.0

2.5 0.80 16.0

3.0 0.72 14.4

3.5 0.69 13.8

4.0 0.60 12.0

2.1.5 磷酸盐对红曲色素生成的影响。

改变培养基中磷酸盐的种类，其他条件不变，分别考察KH2PO4、K2HPO4、Na2HPO4、NaH2PO44种不同的磷酸盐对红曲霉红曲色素产生的影响。

从表5可以看出，不同无机盐发酵产生的红色素色价各有不同，其中KH2PO4和Na2HPO4比K2HPO4和NaH2PO4发酵产生的红色素色价要高，Na2HPO4最好，但KH2PO4成本较低，且发酵产生的红色素色价较高，和Na2HPO4差异不明显。从原材料的来源及贮存等方面考虑，选用KH2PO4为发酵的磷源。

表5 磷酸盐对红曲色素产生的影响

磷酸盐 玂D值 色价∥U/ml

KH2PO4 0.72 14.4

K2HPO4 0.55 11.0

Na2HPO4 0.74 14.8

NaH2PO4 0.61 12.2

2.1.6 表面活性剂对红曲色素生成的影响。

表面活性剂可改变细胞膜的通透性，使代谢产物从细胞中释放出来，从而降低代谢产物对代谢途径的阻遏作用。改变培养基中表面活性剂的种类，考察吐温20、吐温40、吐温60、吐温80及洗衣粉等表面活性剂对红曲霉产生红曲色素的影响。

从表6可以看出，吐温20、吐温40、吐温60、吐温80发酵产生的红曲色素色价差异不大，但其红曲色素明显高于洗衣粉。当使用吐温20作为表面活性剂时，发酵液色价可达14.4 U/ml。

表6 表面活性剂对红曲色素生成的影响

表面活性剂 玂D值 色价∥U/ml

吐温20 0.72 14.4

吐温40 0.70 14.0

吐温60 0.67 13.4

吐温80 0.69 13.8

洗衣粉 0.53 10.6

2.1.7 吐温20用量对红曲色素生成的影响。

改变吐温20用量，分别考察0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%的吐温20对红曲霉红曲色素产生的影响。

从表7可以看出，吐温20在0.05%～2.50%发酵产生的红色素色价逐渐减小，所以，0.05%的吐温20是最适合的表面活性剂的量。

表7 吐温20用量对红曲色素生成的影响

吐温20∥% 玂D值 色价∥U/ml

0.05 0.72 14.4

0.10 0.65 13.0

0.15 0.60 12.0

0.20 0.54 11.8

0.25 0.50 10.0

2.2 培养条件对红曲霉红曲色素产量的影响

2.2.1 温度对红曲色素生成的影响。

分别在26、28、30、32、34、36 ℃下180 r/min振荡培养6 d，其他条件不变，测定其发酵液的红色素色价。

从表8可以看出，在一定温度范围内，随着温度的升高，红色素色价增大。当培养温度为30 ℃时，发酵液的色价最大；温度超过30 ℃，发酵液的色价明显降低。主要原因是因为温度越高，不利于菌体生长，导致产色素量减少。

表8 温度对红曲色素生成的影响

温度∥℃ 玂D值 色价∥U/ml

26 0.71 14.2

28 0.78 15.6

30 0.82 16.4

32 0.70 14.0

34 0.65 13.0

36 0.43 8.6

2.2.2 起始pH对红曲色素生成的影响。

改变培养基的起始pH 5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0，在其他条件不变的条件下，考察不同起始pH对红曲霉红曲色素产量的影响。

从表9可以看出，培养基起始pH为6.0时，是红曲霉合成和分泌红曲色素适宜的pH。

表9 起始pH对红曲色素生成的影响

起始pH 玂D值 色价∥U/ml

5.5 0.75 15.0

6.0 0.80 16.0

6.5 0.72 14.4

7.0 0.67 13.4

7.5 0.64 12.8

8.0 0.58 11.6

2.2.3 种龄对红曲色素生成的影响。

改变接种种龄，其他条件不变，分别考察种龄为48、72、96 h对红曲霉红曲色素产量的影响。从表10可以看出，在72 h时接种的种龄产生的红色素色价最高。

表10 种龄对红曲色素生成的影响

种龄∥h 玂D值 色价∥U/ml

48 0.54 10.8

72 0.57 11.4

96 0.48 9.6

2.2.4 接种量对红曲色素生成的影响。

以4%、6%、8%、10%、12%、14%为接种量，其他成分不变，考察其对红曲霉红曲色素产生量的影响。

从表11可以看出，随着接种量的增加，红色素色价逐渐增大，10%时达到最大值，之后随着接种量的增加，红曲色素色价逐渐减小。主要是因为接种量的增加，导致发酵的前期营养物质消耗过快，发酵液的黏度增加，从而影响菌丝体生长及色素的合成和分泌。

表11 接种量对红曲色素生成的影响

接种量∥% 玂D值 色价∥U/ml

4 0.52 10.4

6 0.53 10.6

8 0.50 11.2

10 0.60 12.0

12 0.46 9.2

14 0.37 7.4

2.2.5 装液量对红曲色素生成的影响。

在250 ml三角瓶中分别装50、60、70、80、90、100、110、120 ml发酵培养基，考察不同装液量对红曲霉红曲色素产量的影响。

从表12中可以看出，在装液量为60 ml时，红色素色价最高。这是因为红曲霉是好氧菌，在营养充足的情况下，装液量越少其通风量越大，溶氧量越多，有利于菌体生长代谢产物，产生色素，因此选用60 ml装液量为最佳。

表12 装液量对红曲色素生成的影响

装液量∥ml 玂D值 色价∥U/ml

50 0.84 16.8

60 0.87 17.4

70 0.85 17.0

80 0.80 16.0

90 0.74 14.8

100 0.69 13.8

110 0.57 11.4

120 0.49 9.8

2.2.6 转速对红曲色素生成的影响。

在其他条件不变的情况下，分别考察140、160、180、200 r/min转速对红曲霉红曲色素产生量的影响。

从表13可以看出，随着转速的增加，红色素色价逐渐增大，180 r/min时达到最大值，之后随着转速的增加红色素色价逐渐减小。因为转速越大，有利于溶氧，从而有利于菌体生长，但是转速过大，虽能增加溶氧量，但因机械损伤加大，从而导致生长的色素降低。

表13 转速对红曲色素生成的影响

转速∥r/min 玂D值 色价∥U/ml

140 0.60 12.0

160 0.69 13.8

180 0.72 14.4

200 0.68 13.6

2.2.7 培养时间对红曲色素生成的影响。

其他条件不变，培养3 d后，每隔24 h随机取样，直至7 d，测定发酵液红曲色素色价。

从表14可以看出，随着培养时间的增加，红色素色价逐渐增大，6 d时到达最大值，之后随着培养时间的增加，红色素色价逐渐减小。因此，适宜的培养时间为6 d。

表14 培养时间对红曲色素生成的影响

培养时间∥d 玂D值 色价∥U/ml

3 0.47 9.4

4 0.52 10.4

5 0.59 11.8

6 0.61 12.2

7 0.56 11.2

3 结论与讨论

通过研究,得到了红曲霉液体发酵产红曲色素适宜的培养基配方为:葡萄糖5%,酵母粉2%,CaCO3 0.2%,NaCl 0.1%,MgSO4.7H2O 0.1% ,KH2PO4 0.2%,吐温20 0.05%。适宜的培养条件是：pH为6.0，在装液量为60 ml/250 ml三角瓶中接种10%种龄为72 h的液体种子，于30 ℃恒温摇床上振荡培养，转速为180 r/min，发酵6 d，发酵液色价可达19.2 U/ ml。

将得到的发酵液浓缩，用减压蒸馏的方法，得到的浓缩液再放入90 ℃的鼓风烘干机中烘干即可得到红色的块状固体［22］。经过4层纱布过滤后的滤渣可以在100 ℃烘干后研磨成粉末，其胞内色素可用70%的乙醇于60 ℃水浴锅中浸提，提取时间为60 min。

红曲霉的研究早已涉入次生代谢产物等生物活性物质，我国红曲生产的优势目前在固态发酵方面，主要用于制作酒曲、白酒酯化和红曲米，作色曲的红曲米及功能红曲米，因我国的红曲米生产成本低，故具有一定的竞争力。我国的另一优势在于拥有丰富的红曲霉菌种资源，有利于结合遗传学进行基因工程改造，更深入地开发红曲霉的潜能。总之，利用常规方法、原生质体融合及基因重组等技术在红曲霉菌株的选育，红曲霉菌发酵先进的生产工艺改进与科学管理，利用酶同定化技术、微胶囊技术对红曲系列产品的研究开发等诸多方面均有较好的发展前景。

参考文献

［1］ 徐坚．初学记［M］．北京：京华出版社，2000：15-17.

［2］ 纪远中．红曲及红曲霉的研究现状及进展［J］．天津药学，2005（2）：22-25.

［3］ 中华人民共和国卫生部.GB2760-2002,中华人民共和国国家标准食品添加剂使用卫生标准［S］.北京：中国标准出版社，2003.

［4］ 章克第.红曲霉及红曲色素［J］.中国调味品,1989(2):1-5.

［5］ 高红.红曲在我国传统食品和食疗保健中的作用［J］.中国酿造,1997(6):11-13.

［6］ 毛宁.红曲霉的有效生理活性物质及其应用［J］.中国调味品,1995(4):8-11.

［7］ WANG S L,YEN Y H.Production of antimicrobial compounds by Monascus purpuieus CCRC31499 using shromp and crab shell powder as a carbon source ［J］.Enzyme Microb Technol,2002,31(3):337-344.

［8］ ALBERTS A W,CHEN J,KUNT V,et al.Mevinolin:a highly potent competitive inhibitor of hydroxymethylglutary瞔oenzyme a reductase and a cholesterol瞝owering agent［J］．Proc Natl Acad Sci USA，l980,77(7):39-57.

［9］ ENDO A,MONACOLIN K.A new hypocholesterolemic agent produced by a Monascus species［J］.J Antibio,1979,32:852-854.

［10］ 夏书华.有关红曲色素的提取及提高其色价的研究［J］.北京农学院学报,1999,14(1):44-45.

［11］ 雷帮星.红曲及其活性物质的研究进展［J］.贵州化工,2004,29(5):12-15.

［12］ 李时珍.本草纲目(下册)［M］.北京：人民卫生出版社,1982:13-15.

［13］ 陈义光.红曲及红曲霉的研究与应用［J］.湖北农学院学报,2000,20(2):188-190.

［14］ 沈士秀.红曲的研究生产及应用［J］.食品工业科技,2001,22（1）:85-87.

［15］ 陈家文.水溶性红曲色素工业性试验研究［J］.食品与发酵工业,1999,28(2):20-21.

［16］ 熊晓辉.红曲色素液体深层发酵工艺研究［J］.南京农业大学学报,1997,20(1):90-95.

［17］ 葛继志.红曲霉异变株产色素发酵条件研究［J］.生物学杂志,1999,16(2):29-30.

［18］ 彭德姣.pH对红曲霉产红曲色素的影响［J］.湖北农学院学报,2002,22(2):147-149.

［19］ 顾玉梅.红曲霉菌发酵工艺条件对色素及桔霉素生产的影响［J］.食品与生物技术,2002,21(1):43-47.

［20］ CARELS M,SHEPHERD D.The effect of different nitrogen sources on pigment production and sporulation of 玀onascus 玸pp. in submerged shaken culture ［J］.Can J,Microbiol,1977,23:1360-1372.

［21］ 贺小贤.生物工艺学原理［M］.北京：化学工业出版社,2003:169-171.

［22］ 李清春.红曲色素的研究及进展［J］.肉类工业,2001,238（4）:25-28.