微生物反硝化及其电化学强化研究进展

（广州市市政集团有限公司，广东广州 510060）お

摘要 微生物反硝化过程是在硝酸盐还原酶、亚硝酸盐还原酶、一氧化氮还原酶、一氧化二氮还原酶及其他一些脱氢酶的作用下，将电子供体的电子传递给NO3-的过程。在此综述了反硝化的各种电子供体及各种碳源。根据碳源的不同，反硝化菌可分为异养型反硝化菌和自养型反硝化菌。针对反硝化的过程，可以通过提供电子供体、加入电子载体、提高酶活性、加速辅酶再生、电刺激提高微生物活性等方法来强化反硝化过程。

关键词 反硝化；电子传递；电子供体；BER；电刺激

中图分类号 SB181.3文献标识码

A文章编号 0517-6611（2014）19-06324-03お

The Mechanism of Denitrification and the Enhancement by Electrode

ZHANG Wan瞙ui(Guangzhou Municipal Group Co. Ltd., Guangzhou, Guangdong 510060)

AbstractThe process of denitrification is transfer of electron from donor to receiver, with the catalysis of corresponding nitrate reductase (NAR), nitrate reductase (NIR), nitric oxide reductase (NOR) and nitrous oxide reductase (N2OR). Various electron donors and carbon sources of denitrification were summarized. Denitrification could be separated to heterotrophic denitrification and autorrophic denitrification, according to the difference of carbon source. Various methods to enhance the effect of denitrification were depicted, such as adding electron donor and electron carrier, enhancing the activity of enzyme, accelerating the regeneration of enzyme, adding electrode field and so on.

Key wordsDenitrification; Electron flow; Electron donor; BER; Electrolytic stimulation

作者简介 张万辉（1983- ），男，河南开封人，工程师，从事于城镇环境化学研究。

收稿日期 20140604

随着工业的发展，硝酸盐在土壤和水环境大量富集，现已是世界各国需要面临的严峻的环境问题［1］。含氮化合物排入到环境中，会引起水体的富营养化，硝酸盐对人和动物会产生危害，能引起婴儿的高铁血红蛋白症［2］。实验室中动物实验已证明，硝酸盐能够引起心脏和行为问题［3］，且由硝酸盐转化成的硝酸铵是强致癌物［4］。目前，各国的学者均在致力于脱除饮用水、水产用水和工业废水中的硝酸根。脱除硝酸盐的方法有物理化学法和生物法。离子交换、吸附、化学处理、膜技术和微生物法已广泛应用，离子交换和吸附法已被应用于生产高纯度水，但交换树脂的吸附容量会迅速饱和，需要不断地更换和再生［5］。膜技术是一种富集的方法，需要在后续处理浓缩液，且不适合于低浓度硝酸盐废水的处理［6］。微生物反硝化相比于其他的方法更加经济有效。笔者在此综述了反硝化的各种电子供体及各种┨荚础＊

1 反硝化的机理

反硝化过程是伴随着电子传递而发生硝酸盐还原的生化过程,研究表明硝酸盐（NO3-）完全还原转化为氮气(N2)包括以下4个过程［7］，即

㎞O3（+5）→㎞O2（+3）→㎞O（+2）→㎞3O（+1）→㎞2（0）。反硝化过程涉及多种酶和多种中间反应产物并伴随着电子的传递，Park等揭示了这些酶和相关反应如图1所示［5，8-9］。由NO3-还原成NO2-的过程在细胞膜中进行，其他3个过程均在周质中进行。NAR是膜结合蛋白，在革兰氏阴性菌种属于周质酶，在反硝化菌细胞内存在2种硝酸盐还原酶，细胞膜内侧的膜内硝酸盐还原酶和细胞膜外侧的膜外硝酸盐还原酶［10-11］。NIR是存在于细胞膜外细胞周质中的周质酶，有含有c和d1 2种细胞色素的Cyt cd1型和含铜催化中心的Cu型［12］。NOR是位于细胞膜上与膜结合的细胞色素bc复合物，由2个亚单位Cyt b和Cyt c结合，该酶含有非血红素铁［13］。N2OR是含有2个Cu活性中心同型二聚体的细胞周质酶［14］。

注：NAR为硝酸盐还原酶；NIR为亚硝酸盐还原酶；NOR为一氧化氮还原酶；N2OR为一氧化二氮还原酶；Cytc为细胞色素；NAD为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸；FeS为铁硫蛋白；CoQ为辅酶Q。

图1 反硝化的生化反应和电子传递

在反硝化过程中，反硝化菌通过电子传递体系将电子传递给最终电子受体硝酸盐［15］，反硝化菌细胞膜内电子载体的氧化还原电位大小顺序依次为NAD+/NADH(-0.320 V)

2 反硝化过程的能量利用

反硝化菌能够利用有机物、无机物和光能等作为其能量的来源。反硝化的生化反应式为［10］：NO3-+2H++2eNaRNO2-+H2O-89.2 kJ/mol、

NO2-+2H++eNiRNO+H2O-32.9 kJ/mol、

2NO+2H++2eNoRN2O+H2O-226.4 kJ/mol、

N2O+2H++2eN2oRN2+H2O-261.8 kJ/mol。

反硝化菌多数为兼性厌氧菌，在以硝酸盐作为电子受体时基质释放的能量会下降，氧化磷酸化仅产生2 mol的ATP［17］。反硝化过程共放出604 kJ的能量，即使这些能量全部转化为ATP，约可产生11.5 mol ATP,属于低级能源。

3 反硝化类型

反硝化菌是以NO3-作为最终电子受体，将NO3-还原为N2的细菌总称。根据对碳素营养物的同化能力的不同分为异养型和自养型反硝化菌，它们的电子供体的反硝化化学反应式如表1所示。

表1 不同碳源的反硝化反应化学反应式

电子供体 化学反应式 参考文献

CH3OH 1.08CH3OH+NO3- +0.24H2CO3→0.06C5H7O2N +0.47 N2+1.68H2O+HCO3- 18

C2H5OH 0.69C2H5OH+NO3-+H+→0.14C5H7NO2+0.43N2+0.67CO2＋2.07H2O 19

CH3COOH 0.82CH3COOH+ NO3- →0.07C5H7O2N+0.47 N2+0.90H2O+HCO3-+0.30CO2 20

C6H12狾6 0.36 C6H12狾6+NO3-+0.18NH4++0.82H+→0.18C5H7O2N+0.5N2+2.28H2O+HCO3-+1.25CO2 21

S 1.10S+NO3-+0.086NH4++0.76H2O+0.4CO2→0.04C5H7O2N+0.48N2+0.98SO42-+HCO3-+0.96 H+ 22

H2S 0.421H2S+0.421HS-+NO3-+0.346CO2+0.086HCO3-+0.086NH4+→0.086C5H7O2N+0.50N2+0.842SO42-+HCO3-+0.262 H++0.434H2O 23

S2O32- NO3-+0.43H2O+0.35CO2+0.87HCO3-+0.087NH4+→0.087C5H7O2N+0.50N2+1.69SO42-+0.7H+ 5

H2 0.303H2+NO3-+0.23 CO2+H+→0.05 C5H7O2N +0.48 N2 3.37H2O 24

e- 2NO3-+6 H2O+10 e- →N2+12OH- 1

3.1 异养反硝化

异养反硝化菌在缺氧的条件下利用各种有机碳源作为能量和电子供体，主要有假单胞菌（Pseudomonas）、脱氮副球菌（Paracoccus）、产碱菌（Alcaligenes）、黄质菌（flavobacterium）和杆菌（Bacillus）等［25］。异养反硝化已经应用于资源回收和传统的污水处理厂。对于市政污水和农业废水，含有大量的有机碳源，反硝化所需的碳氮比（C/N）很容易满足，但大量的工业废水碳源的含量很低，需要投加碳源满足反硝化菌的需要。研究发现，向碳源不足的废水中投加甲醇、乙醇、乙酸、葡萄糖或淀粉等碳源可以有效地促进反硝化反应［21,26］。但反硝化过程投加的碳源也引起了关注。一些有机碳源是有毒物质，反硝化的剩余量将仍然滞留在水中，且一些外加碳源的反硝化的副产物需要作进一步处理［7］。甲醇是现在已知用于反硝化过程最便宜的碳源，目前研究者们致力于研究采用更为廉价的碳源代替甲醇，多种廉价的不溶性碳源用于反硝化，如棉花、麦秆、报纸、锯末、淀粉和植物油等［27-28］。

3.2 自养反硝化

自养反硝化菌利以CO2、CO和CO32-作为碳源，以H2和硫化物等作为电子供体和能量来源。相比于异养反硝化，自养反硝化避免了一些有机碳源的毒害、较低的污泥和基质产生量等优点，避免了反应器的堵塞且简化了预处理。可以作为电子供体的硫化物有S2-、S、S2O32-、S4O62-和SO32-等，相比于甲醇和乙酸等有机碳源，硫的价格较便宜，且反硝化过程可以降低反硝化的费用［29-30］。

氢气由于无毒、清洁、在水中的低溶解性且无代谢基质等优点，已经成为一种理想的反硝化电子供体［24］。利用氢气作为电子受体的反硝化菌主要有Paracoccus菌、Alcaligenes eutrophus菌和Pseudomounas菌等［31-32］，采用氢气作为电子供体能够取得较好的反硝化效果。Gentzar采用氢气代替有机碳作为电子供体，结果发现脱氮效果提高了8.5倍［33］。但氢气在水中的低溶解度（1.6 mg/L,20 ℃）限制了其从气态到液态间的传质速率，从而影响反硝化速率［24］。另外，氢气是一种危险气体，容易发生爆炸，限制了在反硝化过程中的应用［7］。为了克服氢气的缺点，Sakakibara等开发了电化学和微生物耦合的方法，微生物电极反应器（BER），在这个系统中微生物利用阴极电解产生的氢气进行脱氮，研究表明，BER系统能够取得良好的脱氮效果［34］。研究较多的BER是二维电极和微生物的耦合的方法，三维电极和微生物耦合的方法较少，尤其是单极性三维电极和微生物耦合更少（表2）。Zhou等研究了单极性三维电极微生物反应器，第三极活性炭不仅提供了生物膜和氢气形成的点位，且其表面能与O2反应产生CO2，创造更好的缺氧环境，这种BER系统脱氮率可达0.222 mg NO32--N/（cm2·d），电流效率高达227%［35］。在BER系统中，对于电极的作用还没有一致的意见，普遍认为微生物利用阴极电解产生的H2作为电子供体进行反硝化，Park等认为BER系统中，微生物直接利用阴极的电子进行反硝化，在200 mA电流作用下，硝酸盐的最大去除速率达0.17 mg NO32--N/（cm2·d）,去除率高达98％［1］。Zhang等认为阴极所在的一区产生有宜于微生物生长的较低氧化还原电位的环境，从而加速了微生物的反硝化反应［42］。Beschkov等认为电场作用下微生物反硝化作用提高是电化学和微生物活性两方面共同的作用［43］。

4 强化反硝化过程

传统的反硝化过程是在缺氧或厌氧条件下，反硝化菌通过电子传递链将电子从电子供体传递给NO3-，这个过程涉及硝酸盐还原酶、亚硝酸还原酶、一氧化氮还原酶、一氧化二氮还原酶［10］。不同的研究者针对这个过程，采用不同的方法从不同的角度来提高反硝化过程。Robert等将具有电子传递功能的燃料基质藏红T等与NaR、NiR和N2OR等共同固定在阴极表面，发现酶的活性显著提高，能将NO3-彻底还原为N2［44］。微生物反硝化过程是由脱氢酶直接参与的电子传递过程，如果能够加速辅酶的再生就能够提高反硝化的效果，Palmore等采用与NAD+/NADH氧化还原电位接近的联苄吡啶作为电子载体，硫辛酰胺脱氢酶催化NAD+的再生，加速了电子的传递［45］。辅酶再生的方法有化学法、光化学法、酶法和电化学法，现在辅酶再生方法在发酵工程和微生物燃料电池方面研究较多，反硝化过程中的研究还鲜有报道。在低电场下，细胞具有更好的通透性，有利于营养物质的额吸收，胞外酶的活性变强加速了酶催化反应。宋波研究了Enterobacter dissllven在直流电条件下的生长和代谢过程，发现在直流电刺激作用下阴极细菌葡萄糖降解率和脱氢酶活性显著提高［46］。Beschkov等研究了再恒电位下反硝化菌Pseudomonas denitrificans的反硝化过程，发现电解刺激作用显著提高了脱氮效率并缩短了细胞生长停滞期的时间［43］。

表2 各种不同类型的BER反应系统

BER类型 阴极 阳极 处理废水类型 脱氮速率 参考文献

平行板电极BER 金属网 铂电极 反硝化脱氮、排除SS 脱氮速率达16.40 mgN/h ［36］

圆柱型BER 石墨柱 石墨柱 反硝化脱氮 硝酸盐的去除率高达98％ ［37］

棒状BER 不锈钢 石墨棒 反硝化脱氮、中和溶液 实现同时反硝化和去除铜又可调节pH ［38］

管型BER 不锈钢网 不锈钢 反硝化脱氮 实现同时去除2，4睤CP和重金属 ［39］

流化床BER 活性炭纤维饮用水反硝化 反硝化速率达0.031 mgN/（cm2·d） ［40］

三维电极BER 活性炭纤维 PbO2 地下水脱氮 0.222 mgNO32--N/（cm2·d） ［35］

旋转电极BER 旋转圆盘 碳素板 反硝化脱氮 脱氮率达100％ ［41］

5 小结与讨论

反硝化过程是一个涉及到在微生物细胞内外不同位置各种酶参与作用下，通过电子链将电子供体提供的电子传递给NO3-的过程。为了提高反硝化的速率，针对反硝化过程不同阶段，研究者们从不同的方向着手，如采用适宜的电子供体、直接提供电子、提高酶的活性、加速辅酶的再生、采用电子载体传递电子、提高细胞的通透性等来提高反硝化速率。BER系统是微生物和电化学的结合来提高反硝化的速率，现在研究较多的是二维电极BER系统，三维电极BER研究较少尤其是单极性三维BER系统。采用导电且易挂膜的材料作为第三极的单极性BER应是极具潜力的研究领域，但BER系统强化反硝化的机理还未彻底清楚，需要作进一步的研究。

现在已有学者采用微生物燃料电池来提高反硝化速率，直接利用有机物氧化产生的电子通过电极转移到阴极区进行微生物反硝化，既提高了反硝化速率又可以节省电能，此方向是反硝化研究又一新领域。以往的研究只是单纯地针对NO3-的反硝化，如果能够将反硝化过程和难降解有机物共同作为研究对象，同时提高二者去除效果将会更有┮庖濉＊

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