乌贼墨多糖对环磷酰胺介导小鼠睾丸氧化应激损伤的干预效应

谷毅鹏 肖为 张云波 乐小炎 刘华忠 罗萍��

(1.广东海洋大学食品科技学院，广东湛江 524088；2.广东海洋大学农学院，广东湛江 524088；3.广东海洋大学生物化学中心，广东湛江 524088)お

摘要

［目的］ 探讨乌贼墨多糖对环磷酰胺致小鼠睾丸氧化应激损伤的保护作用。［方法］ 随机将70只成年雄性昆明小鼠分成7组：正常组、模型组、治疗组1、治疗组2、治疗组3、治疗组4和治疗组5，通过对小鼠腹腔注射环磷酰胺进行造模，灌胃乌贼墨多糖作为化疗保护剂，检测小鼠的体重、睾丸和附睾重量、睾丸指数和附睾指数、精子畸形率、睾丸中抗氧化指标，同时观察睾丸组织结构。［结果］ 乌贼墨多糖能提高小鼠体重和睾丸重量，降低精子畸形率，提高睾丸组织中抗氧化酶SOD和CAT活性，降低MDA含量，修复睾丸病理学损伤。乌贼墨多糖明显缓解环磷酰胺对睾丸的氧化损伤，其最佳灌胃剂量为80 mg/kg。［结论］ 乌贼墨多糖有可能作为临床上的化疗辅助药物。

关键词 乌贼墨多糖；环磷酰胺；小鼠；睾丸；抗氧化

中图分类号 SB917;RB282.77文献标识码 A文章编号 0517-6611（2014）19-06275-04

Interventional Effects of Sepia Polysaccharide against Cyclophosphamide瞚nduced Oxidative Stress Injury to Testis of Mice

GU Yi瞤eng, LUO Ping et al

(School of Food Science & Technology, Guangdong Ocean University, Zhanjiang，Guangdong524088)

Abstract ［Objective］ The research aimed to discuss the protection effects of sepia polysaccharide on the cyclophosphamide瞚nduced oxidative stress injury to testis of mice. ［Method］ Seventy adult male Kunming mice were randomly divided into seven groups: normal group, model group , treatment groups Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ, Ⅳ, Ⅴ. Mice in model group were administrated by using intraperitoneal injection. The sepia polysaccharide was used as chemoprotectant for intragastric administration. The body weight, the weight of testis and epididymis, testis index and epididymis index，abnormal sperm rate and antioxidant indices in testis were detected. And the histological structure of testis was observed. ［Result］ Sepia polysaccharide could enhance the body weight and testis weight，reduce the rate of abnormal sperm，increase the activities of SOD and CAT, decrease MDA content and restore the histopathological injury of testis. The best dosage of sepia polysaccharide for intragastric administration was 80 mg/kg. ［Conclusion］ Sepia polysaccharide might be used as the chemotherapy's adjunctive drug in the clinic.

Key words Sepia polysaccharide; Cyclophosphamide; Mice;Testis; Antioxidation

基金项目 国家自然科学基金项目（41306149，31171667）。

作者简介 谷毅鹏（1987-），男，河南洛阳人，硕士研究生，研究方向：海洋生物活性物质研究。*通讯作者，讲师，硕士，从事天然产物与功能食品研究。

收稿日期 20140526

环磷酰胺(Cyclophosphamide，CP)是一类双功能烷化剂，可有效治疗多种恶性肿瘤，也可作为免疫抑制剂，用于器官移植、类风湿性关节炎和全身性红斑狼症等疾病的治疗，是一种应用非常广泛的临床药物［1-3］。但是，环磷酰胺在抑制肿瘤细胞增殖的同时，也会影响正常细胞的增殖和分化［4］，从而产生较多毒副作用，对生殖系统特别是男性睾丸的毒性损伤就是其中之一。大量研究表明，腹腔注射环磷酰胺可明显降低小鼠睾丸的生精功能［5］，破坏睾丸组织内氧化-抗氧化系统的平衡，产生大量自由基以及氧化产物，造成睾丸氧化应激损伤［6］。乌贼墨多糖（Squid ink polysaccharide，SIP）提取自海洋活性物质乌贼墨，是一种高效、无毒、广谱类细胞保护剂，具有抗氧化［7］、抗肿瘤［8］、抗化疗［9］、增强免疫［10-11］等生物学活性。近年来，乐小炎等发现乌贼墨多糖对化疗药物环磷酰胺造成的毒性损伤具有较强的缓解能力，其中对环磷酰胺所致的雄性生殖损伤改善作用也非常明显［12-13］。笔者从乌贼墨多糖缓解环磷酰胺所致小鼠睾丸氧化损伤的角度来研究乌贼墨多糖对环磷酰胺致小鼠睾丸氧化应激损伤的保护作用，为临床上开发化疗的辅助药物提供一定理论依据。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1

实验动物。

清洁级昆明小鼠70只，雄性，6周龄，购自广西医科大学实验动物中心，合格证编号为0006318，在广东海洋大学生化中心实验动物房适应性饲养1周。

1.1.2

主要试剂。乌贼墨多糖由实验室自制［13-14］。

注射用环磷酰胺（CP），购自江苏恒瑞医药股份有限公司；考马斯亮蓝蛋白定量测试盒、总超氧化物歧化酶（T睸OD）测试盒、丙二醛（MDA）测试盒和过氧化氢酶（CAT）测试盒，均购自南京建成生物工程研究所；其他试剂均为分析纯。

1.1.3

主要仪器。HH6型数显电子恒温水浴锅；KDC160HR型高速冷冻离心机；FDU1100型真空冷冻干燥机；UV2800AH型紫外可见分光光度；N1000型旋转蒸发仪；JY92并蛐统声波细胞粉碎机；BX51型多功能显微镜。

1.2试验方法

1.2.1

实验动物处理及体重测定。

取70只雄性昆明小鼠随机分成5组：对照组（A）、模型组（B）、治疗组1（C）、治疗组2（D）、治疗组3（E）、治疗组4（F）和治疗组5（G），每组10只。治疗组每天灌胃乌贼墨多糖，C、D、E、F和G各组用量分别为25、40 、60 、80 、100 mg/(kg·d)； 对照组和模型组动物按同样方法每天给予等量生理盐水；灌胃至第7天，模型组和治疗组小鼠需腹腔注射环磷酰胺，剂量为120 mg/kg，对照组腹腔注射等量生理盐水；各组实验动物均连续处理14 d，每隔1 d称1次体重。

1.2.2

生殖器官指数的测定。在末次给药24 h后，称量小鼠体重，然后脱颈椎处死，取双侧睾丸和附睾，迅速清除组织周围脂肪并称重。按照以下公式计算小鼠睾丸和附睾指数：生殖器官指数（睾丸/附睾）=每只小鼠生殖器官（睾丸/附睾）重量/每只小鼠体重×100%。

1.2.3

精子畸形率的测定。

将含有1 ml 0.9%生理盐水的离心管置于37 ℃水浴锅中预热，取单侧附睾纵向剪成3段，放入离心管中轻轻摇动，37 ℃下温育5~10 min，使精子充分游出，然后吸取此精子悬液10 μl滴于洁净载玻片一端，均匀推片，待玻片晾干后用甲醇固定5 min以上，再次晾干后用1%伊红染色1 h，用水轻冲，干燥，在显微镜下观察精子畸┬温省＊

1.2.4

睾丸组织的病理学检测。

取睾丸组织，用10%的甲醛溶液固定，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，5 μm切片，HE染色，在显微镜下观察睾丸组织结构变化。

1.2.5

睾丸抗氧化指标的测定。

取一侧睾丸，加生理盐水，冰上研磨，制成10%组织匀浆，3 000 r/min离心，取上清。按照试剂盒说明书，采用比色法测定睾丸组织中超氧化物歧化酶（SOD）活性、过氧化氢酶（CAT）活性以及丙二醛（MDA）┖量。

1.2.6

数据处理。使用SAS公司开发的JMP7.0软件对试验数据进行统计与分析，结果用“平均值±标准差”表示。

2 结果与分析

2.1 体重变化

从图1可以看出，在注射环磷酰胺前，各组小鼠体重变化并无显著差异（玃>0.05），均呈上升趋势；注射环磷酰胺后，模型组和治疗组1、2的小鼠体重总体均处于下降趋势，治疗组3的动物体重先下降，但第11天后开始上升，对照组和治疗组4、5体重一直处于上升状态；各组小鼠体重从13天开始出现明显差异，第15天模型组同对照组相比体重显著降低（玃<0.01），与模型组相比，治疗组3、4、5小鼠体重均明显增高，差异极显著（玃<0.01）。这说明乌贼墨多糖可有效缓解环磷酰胺对雄性小鼠体重的影响，恢复体重的最小灌胃剂量是60 mg/kg。

2.2 生殖器官指标

由表1可知，与对照组相比，模型组小鼠睾丸重量明显降低，差异显著（玃<0.05），睾丸指数也有所降低，但差异并不显著（玃>0.05），附睾重量和附睾指数也均无明显差异（玃>0.05），表明环磷酰胺对小鼠的睾丸重量有较强抑制作用；与模型组相比，治疗组4、5小鼠经SIP灌胃后睾丸指数显著增高（玃<0.05），而治疗组各组附睾重量和附睾指数的也均无明显变化（玃>0.05）。这说明乌贼墨多糖主

注：不同小写字母表示差异显著（玃<0.05）；不同大写字母表示差异极显著（玃<0.01）。A.对照组；B.模型组；C.治疗组1；D.治疗组2；E.治疗组3；F.治疗组4；G.治疗组5。

图1 各组试验小鼠体重的变化

要缓解环磷酰胺对雄性小鼠睾丸重量的影响，其最小灌胃剂量为80 mg/kg。

表1 各组小鼠生殖器官指标的变化(玭=10，x±s)

组别 睾丸重量mg 睾丸指数mg/g 附睾重量mg 附睾指数mg/g

对照组 22.23±2.40a 6.63±0.30 55.25±3.42 1.59±0.14

模型组 17.94±2.87b 6.19±0.62 52.67±5.59 1.54±0.15

治疗组1 18.21±2.72ab 6.27±0.69 53.78±5.96 1.58±0.13

治疗组2 19.49±1.30ab 6.32±0.74 52.10±4.76 1.59±0.17

治疗组3 20.03±2.68ab 6.41±0.82 54.70±5.45 1.59±0.20

治疗组4 21.94±1.83a 6.58±0.73 52.88±3.75 1.56±0.17

治疗组5 21.70±1.59a 6.52±0.78 56.50±6.15 1.59±0.12

注：同列不同小写字母表示差异显著（玃<0.05）。

2.3 精子畸形率

由表2可知，模型组小鼠精子畸形率明显高于对照组（玃<0.01），精子畸形类型主要为头部畸形，其中无钩、胖头及香蕉头所占比例较高，说明精子在发育过程中头部更容易受环磷酰胺的毒害，诱发畸变；与模型组相比，治疗组2、3精子畸形率明显降低（玃<0.05），随着乌贼墨多糖灌胃剂量的增加，治疗组4、5精子畸形率大大降低（玃<0.01），缓解环磷酰胺对小鼠精子损伤的最低灌胃剂量为40 mg/kg。

表2各组小鼠精子畸形率的变化(玭=10，x±s)

组别

各类畸形精子数

无钩 无定形 香蕉头 胖头 尾折叠 其他 总计 畸形率%

对照组 88.70 57.98 8.93 16.02 1.56 2.94 176.13 8.81±0.92Bb

模型组 128.62 101.69 16.39 21.96 3.33 4.54 276.54 13.83±2.04Aa

治疗组1 102.42 81.78 13.54 19.68 1.01 2.51 220.95 11.05±1.85 ABab

治疗组2 96.09 63.55 11.22 16.05 2.14 3.36 192.40 9.62±2.39 Bb

治疗组3 112.66 64.26 11.33 20.41 0.96 2.87 212.50 10.62±1.14 ABb

治疗组4 80.74 69.37 11.70 15.62 1.57 2.90 181.90 9.09±2.17 Bb

治疗组5 87.82 65.44 7.63 15.57 1.18 2.23 179.87 8.99±2.71 Bb

注：各组检测小鼠精子总数均为2000。同列不同小写字母表示差异显著（玃<0.05）；同列不同大写字母表示差异极显著（玃<0.01）。

2.4 睾丸形态学观察结果

从图2可以看出，正常组（A）小鼠睾丸曲细精管上皮厚，细胞层数多，生精细胞排列紧密且规则，间质稀少，血管丰富；模型组（B）曲细精管明显变薄，管腔内空洞化，细胞层数减少，内部生精细胞少且排列松散紊乱，间质明显有较大空隙，血管稀少；治疗组1（C）曲细精管厚度有所增加，但管腔内仍有明显空洞化，间质变小；治疗组2（D）曲细精管细胞层数增加，管腔内空洞化明显减少，但生精细胞数较少，间质空隙少；治疗组3（E）曲细精管无空洞化，精管上皮层厚，生精细胞数目较多，间质少；治疗组4（F）和治疗组5（G）睾丸在光镜下与正常组基本相同，曲细小管管壁厚，细胞层较宽，生精细胞丰富且排列规则，间质稀少，血管丰富。由此可见，乌贼墨多糖可恢复环磷酰胺对睾丸组织造成的病理损伤，当灌胃剂量大于60 mg/kg时可明显减少曲细精管空洞化，减少间质，提高生精细胞数目。

注：A.对照组;B.模型组;C.治疗组1;D.治疗组2;E.治疗组3;F.治疗组4；G.治疗组5。

图2各组小鼠睾丸组织切片观察

2.5 抗氧化指标

由表3可知，模型组小鼠注射环磷酰胺后，与对照组相比，睾丸组织中抗氧化酶SOD和CAT活力均显著降低（玃＜0.01），MDA含量明显升高（玃＜0.05）；治疗组小鼠随着乌贼墨多糖灌胃剂量的增加，睾丸中SOD和CAT活性不断增高，而MDA含量不断降低。其中，与模型组相比，治疗组2、3、4、5睾丸中SOD活性均显著恢复（玃＜0.01）；而CAT活性从治疗组3开始明显恢复（玃＜0.05），治疗组5已恢复至正常组水平（玃＜0.01）；治疗组4和5小鼠睾丸组织中MDA含量也均明显降低（玃＜0.05）。这表明乌贼墨多糖可显著缓解环磷酰胺对小鼠睾丸组织造成的氧化损伤，提高睾丸组织中SOD和CAT活性，降低MDA含量，提高整体抗氧化能力的最佳灌胃剂量为80 mg/kg。

お

表3 各组小鼠睾丸组织中抗氧化指标（玭=10，x±s)

组别 SOD活性U/mg CAT活性U/mg MDA含量nmol/mg

对照组 110.94±12.58Aa 14.75±1.15Aa 3.23±1.30b

模型组 72.64±8.14Bc 11.63±1.15Bb 5.71±2.62a

治疗组1 84.84±7.56ABbc 12.77±1.04ABab 4.14±1.17ab

治疗组2 95.09±6.77Aab 13.49±0.49ABab 3.64±1.13ab

治疗组3 101.67±12.98Aab 14.17±1.96ABa 3.52±1.26ab

治疗组4 103.70±7.08Aab 14.08±1.12ABa 3.38±1.06b

治疗组5 102.57±10.26Aab 14.46±2.21Aa 3.37±1.06b

注：同列不同小写字母表示差异显著（玃<0.05）；同列不同大写字母表示差异极显著（玃<0.01）。

3 小结

环磷酰胺是临床上应用十分广泛的化疗药物，毒副作用强，会导致生殖不育或遗传毒害。大量研究表明，环磷酰胺主要作用于细胞快速分裂增殖的组织，而睾丸就是其中的靶器官之一，该药可对DNA产生烷化作用，从而干扰细胞内的多种生物学功能，致使生精细胞凋亡，睾丸染色体畸变，睾丸萎缩，造成生育能力降低以及子代遗传性缺陷等［15-17］。该研究结果表明环磷酰胺可导致小鼠的体重减轻，睾丸萎缩，精子大量畸形，曲细精管空洞化，生精细胞数量减少，间质细胞破坏严重，睾丸组织中抗氧化酶SOD和CAT活性明显降低，MDA含量过度积累，造成睾丸组织严重氧化损伤。

乌贼墨多糖作为一种较强抗氧化能力的海洋活性物质［18］，能较大范围内有效弱化化疗药物对机体组织产生的氧化性损伤，如造血系统、生殖系统、肾、肝、肺、脑等［13,19-22］，通过提高这些组织器官的抗氧化能力，从而减弱化疗药物的毒副作用。该研究结果表明乌贼墨多糖可以缓解化疗药物环磷酰胺造成的睾丸氧化损伤，主要表现在以下方面：①提高生精功能，最直接的表现是修复睾丸组织的病理学损伤，防止睾丸萎缩，提高生精细胞数目，降低畸形率；②提高组织抗氧化能力，SOD和CAT是机体内重要的抗氧化酶，而MDA含量反映组织细胞膜质的过氧化程度，乌贼墨多糖可通过提高睾丸中SOD和CAT活性以及降低MDA的含量，有效清除组织内积累的过量自由基，避免睾丸的氧化损伤；③提高机体免疫能力，降低环磷酰胺对免疫系统的抑制作用，从而避免小鼠体重以及睾丸重量的下降，间接发挥保护作用。综上所述，乌贼墨多糖有效缓解环磷酰胺对睾丸组织氧化损伤的最佳灌胃剂量为80 mg/kg。据此推测，乌贼墨多糖可以作为临床上的化疗辅助药物，用于病人在化疗后的康复治疗，同时对扩大药源以及海洋资源的充分开发和利用均具有重大意义。

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