离子液体对靶标生物和非靶标生物AChE的影响

2014-04-29卢嫚罗帅韩旭洋马玲

安徽农业科学 2014年19期

卢嫚罗帅韩旭洋马玲

（1.东北林业大学，黑龙江哈尔滨 150040；2.哈尔滨师范大学，黑龙江哈尔滨 150025）お

摘要［目的］探究不同离子液体对靶标生物及非靶标生物体内酶活性的影响，明确其对靶标生物的毒杀作用及对非靶标生物的安全性。［方法］研究了3种离子液体对2种生物体内AChE活性的影响。［结果］溴化1惨一3布谆咪唑对斜纹夜蛾AChE活性的影响在獿C20浓度处理下呈抑制趋势，獿C50浓度处理下呈先抑制后诱导的趋势；对斑马鱼肝脏AChE活性的影响在獿C20浓度处理下呈始终抑制趋势，在獿C50浓度处理下呈诱导-抑制-诱导的趋势。溴化1捕』3布谆咪唑对斜纹夜蛾AChE活性的影响在獿C20浓度处理下呈先抑制后诱导的趋势，在獿C50浓度处理下呈抑制趋势；对斑马鱼肝脏AChE活性的影响在獿C20浓度处理下呈先诱导后抑制的趋势，在獿C50浓度处理下呈抑制趋势。1，2捕甲基咪唑对斜纹夜蛾AChE活性的影响在獿C20浓度处理下呈先抑制后诱导的趋势，在獿C50浓度处理下呈先诱导后抑制的趋势；对斑马鱼肝脏AChE活性的影响在獿C20浓度处理下呈抑制趋势，在獿C50浓度处理下呈先抑制后诱导趋势。［结论］ 3种离子液体在斑马鱼和斜纹夜蛾体内的积累对2种生物体内AChE的活性均有不同程度的影响，改变生物体内神经信号的传导，导致生物体严重的行为改变、功能紊乱、瘫痪，从而产生毒害作用。

关键词离子液体；AChE酶；斜纹夜蛾；斑马鱼

中图分类号 SB433文献标识码 A文章编号 0517-6611（2014）19-06250-03

お

Impact of Ionic Liquid on the AChE Enzymatic Activity of the Target Organisms and Non瞭arget Organisms

LU Man, MA Ling et al

(Northeast Forestry University, Harbin, Heilongjiang 150040; Harbin Normal University, Harbin, Heilongjiang 150025)

Abstract［Objective］ To explore the impact on the acetylcholinesterase (AChE) enzymatic activity of different ionic liquids to target organisms and non瞭arget organisms. Clarify its toxic effect on the target organisms and non瞭arget organisms security. ［Method］ Effects of three kinds of ionic liquids on AChE enzymatic activity of both creatures body were studied. ［Result］ Impact on the AChE activity of 1睧thyl3瞞ethylimidazolium Bromide to 玃rodenia litura from view after 獿C20 concentrations were always inhibited trend, after 獿C50 concentrations were from inhibited to induced trend; To liver of 獴rachydanio rerio from view after 獿C20 concentrations were always inhibited trend, after 獿C50 concentrations were induced瞚nhibited瞚nduced trend;1睟utyl3瞞ethylimidazolium Bromide to 玃rodenia litura from view after 獿C20 concentrations were from inhibited to induced trend, after 獿C50 concentrations were always inhibited trend; To liver of 獴rachydanio rerio from view after 獿C20 concentrations were from induced to inhibited trend, after 獿C50 concentrations were always inhibited trend;1,2睤imethylimidazole to 玃rodenia litura from view after 獿C20 concentrations were from inhibited to induced trend, after 獿C50 concentrations were from induced to inhibited trend; To liver of 獴rachydanio rerio from view after 獿C20 concentrations were always inhibited trend, after 獿C50 concentrations were from inhibited to induced trend. ［Conclusion］ Have different levels of impact on three kinds of ionic liquids in 獴rachydanio rerio accumulating and 玃rodenia litura body of two kinds of AChE activity 玦n vivo, in vivo 玞hanges in the conduction of nerve signals, causing organisms severe behavioral changes, disorders, paralysis, resulting in toxic effects.

Key wordsIonic liquids; AChE; 玃rodenia litura; 獴rachydanio rerio

お

基金项目黑龙江省教育厅项目（12531217）。

作者简介卢嫚（1982- ），女，黑龙江哈尔滨人，讲师，硕士，从事森林病虫害防治研究。*通讯作者，教授，博士，博士生导师，从事森林保护研究。

收稿日期 20140603

离子液体是在室温下为液体的离子化合物，近几年来已被开发成一种新型绿色化学反应介质。目前，国内外对于离子液体的研究主要集中在合成、物化性质等领域。斜纹夜蛾（玃rodenia litura）属鳞翅目夜蛾科又名莲纹夜蛾，为农作物害虫。我国除青海、新疆未明外，各省（自治区）都有发生。斜纹夜蛾易饲养且发生世代多［1］、抗氧化性强。

斑马鱼（獴rachydanio rerio），又名花条鱼、蓝条鱼，原产地为孟加拉国、印度［2］。它拥有其他模式生物所无法比拟的优点，具有繁殖能力强、体外受精和发育、性成熟周期短、个体小、易养殖等诸多特点，成为最重要的模式动物之一［3］。斑马鱼已被广泛应用于生物学各领域［4］，如发育生物学［5-8］、遗传学［9-10］、肿瘤学［11］、毒理学［12-14］等。为此，笔者以斜纹夜蛾和斑马鱼为研究对象，研究了3种离子液体分别对二者体内乙酰胆碱酯酶（AChE）活性的影响，以期为开发绿色、高效、安全的新型杀虫剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1供试药剂。

1，2捕甲基咪唑、溴化1惨一3布谆咪唑、溴化1捕』3布谆咪唑均购于上海江莱生物科技有限公司；磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、丙酮、乙醇、考马斯亮蓝均购于黑龙江哈尔滨益世达化学试剂有限公司；碘化乙酰硫代胆碱购于Amresco公司；毒扁豆碱购于Sigma公司。

1.1.2供试生物。

1.1.2.1斜纹夜蛾。

将购于湖南农业大学的斜纹夜蛾成虫饲养于养虫室内，保持温度（26±1）℃，相对湿度 60%~70%，光暗周期比为16∶8 h。待卵孵化后，以购买的饲料饲养幼虫。选用虫体大小一致、健康的4龄幼虫作为试虫。

1.1.2.2斑马鱼。

斑马鱼购于哈尔滨市大发市场。体长为（2.5±0.2）cm，体重为（0.24±0.05）g。供试用水为经过曝气处理24 h以上的去氯自来水，pH为6.5~7.5。试验前，将斑马鱼在供试用水中驯养7 d，自然死亡率小于1%，水温在23~27 ℃，试验前1 d停止喂食，在试验期间不投放鱼食，试验用水与之前驯养供试用水一致，光暗周期比为12∶12 h。

1.2 方法

1.2.13种离子液体对斜纹夜蛾体内AChE活性的影响。

1.2.1.1试虫处理。

根据3种离子液体对斜纹夜蛾4龄幼虫的毒力测定结果［15］，以48 h的獿C50为基准，选取丙酮液（丙酮∶蒸馏水=2∶1，玍/V）配制成母液，之后再用蒸馏水稀释成亚致死浓度獿C20，以相同溶剂作为对照组。将健康、大小一致的4龄斜纹夜蛾幼虫放入培养皿中，每个处理15头，每个浓度3个重复，分别于触杀处理 12、24、36、48 h后取样，储存于-20 ℃冰箱用于制备酶液。

1.2.1.2 酶液制备。

从每个处理组中随机选取2头斜纹夜蛾幼虫，加1 ml经预冷过的提取液，置于冰浴过的玻璃匀浆器内充分匀浆，AchE离心参数为4 000 r/min，离心15 min，匀浆液为0.2 mol/L PBS（pH 7.5）。

1.2.1.3酶活性测定。

蛋白质含量测定参照Bradford［16］的考马斯亮蓝G250法。

参照Ellman等的方法［17］，略有改进。以1.5 mmol/L碘化硫代乙酰胆碱作底物，AChE水解后产生乙酸和硫代胆碱，与1.0 mmol/L显色剂DTNB生成黄色物质，用0.000 1 ﹎ol/L毒扁豆碱终止反应，测定玂D412值。

1.2.23种离子液体对斑马鱼体内AchE活性的影响。

1.2.2.1斑马鱼的处理。

根据罗帅等［18］对斑马鱼毒力测定的方法，通过试验获得3种离子液体对斑马鱼的毒力测定结果，以48 h的獿C50为基准，选取丙酮液（丙酮∶蒸馏水=2∶1，玍/V）配制成母液，之后再用蒸馏水稀释成亚致死浓度獿C20，以相同溶剂作为对照组。将活泼、大小一致的斑马鱼投放至5 L玻璃缸中，每个处理15条斑马鱼，每个浓度设2个平行试验，分别暴露1、7、14、21 d，然后分别于1、7、14、21 d后随机挑取活的斑马鱼，储存于-20 ℃冰箱用于制备┟敢骸＊

1.2.2.2 酶液制备。

从每个处理组中随机选取2条斑马鱼，将肝脏解剖出鱼体，加1 ml经预冷过的提取液，置于冰浴过的玻璃匀浆器内充分匀浆，置于4 ℃离心机内进行离心，上层清液即为酶液。AChE离心参数为4 000 r/min，离心15 min，匀浆液为0.2 mol/L PBS（pH 7.5）。

1.2.2.3 酶活性测定。方法同“ 1.2.1.3 ”。

1.2.3 数据处理。

用SPSS 18.0软件统计同一时间处理下不同浓度3种离子液体对斜纹夜蛾和斑马鱼的AChE的活性，采用Duncans新复极差法进行差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 3种离子液体对斜纹夜蛾AChE活性的影响

2.1.1溴化1惨一3布谆咪唑对斜纹夜蛾体内AChE活性的影响。

由图1可知，在12、24、36和48 h时，经过獿C20浓度处理过的斜纹夜蛾体内AChE的活性均低于对照组，抑制作用显著，其中12 h的抑制作用最大，抑制率为52.00%；在12、24、36 h时经过獿C50处理过的斜纹夜蛾体内AChE的活性均低于对照组，其中12和36 h时抑制作用显著，12 h的抑制作用最大，抑制率为20.34%。48 h时活性高于对照组，为对照组的1.25倍，诱导作用显著。