气相色谱法测定新疆桑枝多糖中单糖组成及含量

孙莲 孟磊 阿布都许库尔.吐尔逊

（新疆医科大学药学院化学教研室，新疆乌鲁木齐 830054）お

摘要 ［目的］建立测定桑枝多糖中单糖的组成及含量的方法。［方法］水提醇沉法提取桑枝多糖，CF3COOH水解多糖，水解产物用盐酸羟胺、吡啶和醋酸酐衍生化，生成糖腈乙酸酯衍生物，气相色谱法测定桑枝多糖的单糖组成及含量。［结果］新疆桑枝多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖等组成，含量分别为鼠李糖（11.8 mg/ml）、阿拉伯糖（14.4 mg/ml）、木糖（1.6 mg/ml）、甘露糖（1.9 mg/ml）、葡萄糖（22.3 mg/ml）及半乳糖（28.0 mg/ml）。［结论］该方法简便、灵敏、准确可靠，可用于桑枝多糖中单糖的组成及含量┎舛ā＊

关键词 桑枝；多糖；气相色谱法

中图分类号 SB567文献标识码 A文章编号 0517-6611（2014）19-06207-02

Determination of the Components and Contents of monosaccharides in Polysaccharide of Ramulus Mori from Xinjian by Gas Chromatography

SUN Lian et al

(College of Pharmacy, Xinjiang Medical University, Urumqi, Xinjiang 830054)

Abstract ［Objective］ To establish a method for determining components and contents of monosaccharides in polysaccharides of Ramulus Mori. ［Method］ The polysaccharide was extracted by water and precipitated by alcohol, the polysaccharide was hydrolyzed by CF3COOH. Hydrolyzate was derivatized with hydroxylamine hydrochloride, pyridine and acetic anhydride and sugar nitrile acetate derivatives were produced. The composition and content of monosaccharide of polysaccharides of Ramulus Mori were determined by GC. ［Result］ The polysaccharides of Ramulus Mori were composed of rhamnose, arabinose, xylose, mannose, glucose, galactose. The contents were rhamnose (11.8 mg/ml), arabinose (14.4 mg/ml), xylose (1.6 mg/ml), mannose (1.9 mg/ml), glucose (22.3 mg/ml) and galactose (28.0 mg/ml) respectively. ［Conclusion］ The method is simple, sensitive and accurate. It can be used to determine the contents and components of monosaccharides in polysaccharide of Ramulus Mori.

Key words Ramulus Mori; Polysaccharide; GC

基金项目 新疆维吾尔自治区自然基金（2013211A055）。

作者简介 孙莲（1961- ），女，江苏南京人，教授，硕士，从事药物成分分析研究。

收稿日期 20140528

桑枝（RAMULUS MORI）是桑科桑属植物桑（玀orus alba L.）的一年生干燥嫩枝，是中医常用的传统药材，具有祛风活络、通利关节和燥湿利水之功效［1］。桑枝中的主要功效成分为多糖、黄酮类和生物碱类。现代药理研究证明，桑枝多糖具有抗炎、抗氧化、抗衰老、防癌、抗溃疡、解痉、抗菌、提高机体免疫功能以及降糖降脂等多种功能［2-8］。测定桑枝多糖中单糖的组成及含量对桑枝的开发利用及药效学研究十分必要。笔者利用气相色谱法对桑枝多糖的组成及含量进行测定［10］，以期为新疆桑枝的质量控制和开发利用提供参考数据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 研究对象。桑枝，采自新疆喀什，经新疆医科大学药学院天然药物教研室帕丽达·阿不力孜教授鉴定为桑的干燥嫩枝。

1.1.2 主要仪器。GC2010 Plus氢火焰离子化检测器，购自岛津公司。

1.1.3 主要试剂。鼠李糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖和半乳糖，均为生化试剂，购自成都科龙化工试剂厂；CF3COOH、醋酸酐、盐酸羟胺、吡啶和氯仿均为分析纯，市售。

1.2 方法

1.2.1 色谱条件。色谱柱为RTX瞁AX 毛细管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；检 测 器 为 FID；程序升温为155 ℃（保持1 min），以0.4 ℃/min升至160 ℃（保持2 min），再以0.5 ℃/min升至169 ℃，以0.2 ℃/min的升温速率升高到172 ℃；进样温度为235 ℃；检测器温度为280 ℃；分流比10∶1，载气为高纯N2，进样量 10.0 μl。

1.2.2 桑枝多糖的提取。称干燥至恒重并过60目筛的桑枝粉100.00 g，加适量的水，95 ℃时超声提取30 min，过滤，滤渣再提取30 min，合并滤液，将滤液浓缩至100 ml，加浓度95%乙醇至含醇量达85%，4 ℃时静置过夜，离心分离，得粗多糖。于上述粗多糖溶液中加入2%木瓜蛋白酶，60 ℃时酶解2 h，再用Sevag法（氯仿∶正丁醇=4∶1）除蛋白12次；H2O2脱色，醇沉并离心分离；沉淀物自然干燥，得淡黄色的桑枝┒嗵恰＊

1.2.3 标准单糖的衍生化。精密称取鼠李糖、木糖、葡萄糖、甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖标准单糖各10.0 mg于具塞试管中，加入10.0 mg的盐酸羟胺及0.5 ml的吡啶，混匀后封管，于95 ℃水浴中反应30 min，取出冷至室温，再于其中加乙酸酐 0.5 ml，摇匀后封管，于95 ℃水浴中反应30 min，待乙酰化反应完成后，70 ℃水浴中用N2将产物吹干，用氯仿5.0 ml溶解残渣，进样1.0 μl。

1.2.4 桑枝多糖的水解和衍生化。精密称取桑枝多糖10.0 mg于具塞试管中，加入4.0 mol/L CF3COOH 1.0 ml，摇匀，110 ℃水浴中水解12 h，于70 ℃水浴用N2将产物吹干，按“1.2.3”项下标准单糖衍生化的方法将水解产物衍生化，进样1.0 μl。

1.2.5 方法学考察。（1）系统性试验。取适量对照品溶液和供试品溶液，在上述色谱条件下进样，考察系统适应性。（2）线性关系的考察。分别精密吸取衍生化后的单糖标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml于6个10 ml的容量瓶中，用氯仿稀释至刻度，配成一系列质量浓度不同的混合标准液，进样，记录峰面积，以质量浓度（玐）为横坐标，峰面积（Y）为纵坐标，进行线性回归，计算各个单糖的标准曲线、线性范围、相关系数。（3）精密度试验。取同一混合标准品溶液，连续进样6次，测得峰面积，计算各单糖峰面积的玆SD。（4）稳定性试验。吸取同一供试品溶液，在0、2、4、8、12 h各进样1次，记录峰面积，计算各单糖含量的玆SD。（5）重复性试验。取6份桑枝多糖，按“1.2.4”项下水解和衍生化多糖，测得其中各单糖含量的玆SD。（6）加样回收试验。取9份桑枝多糖，3份留为本底，在其他的6份中加入一定量的各标准单糖，按“1.2.4”项下水解和衍生化多糖，测定峰面积，带入标准曲线计算回收率，各单糖的平均回收率和RSD（n=6）。

1.2.6 桑枝多糖中单糖的含量测定。根据保留时间及加标峰增高法，可确定新疆桑枝多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖及半乳糖组成。将“1.2.4”项下制备的桑枝供试品溶液进样10.0 μl，测定其中各单糖的峰面积，由各单糖的标准曲线计算出桑枝多糖中单糖的含量。

2 结果与分析

2.1 方法学考察 （1）系统性试验。图1表明，对照品溶液和供试品溶液图谱在相同时间上有对应的吸收峰，各峰间分离度良好，彼此无干扰，表明系统适应性良好。（2）线性关系的考察。由表1可知，在各自范围内，各单糖浓度与峰面积的线性关系良好。（3）精密度试验。计算得各单糖峰面积的玆SD别为鼠李糖（1.2%）、阿拉伯糖（0.97%）、木糖（1.9%）、甘露糖（0.97%）、葡萄糖（2.4%）和半乳糖（1.1%），表明精密度良好。（4）稳定性试验。计算得各单糖含量的玆SD分别为鼠李糖（1.2%）、阿拉伯糖（1.5%）、木糖（0.89%）、甘露糖（2.1%）、葡萄糖（1.2%）、半乳糖（2.9%），表明供试品溶液在12 h内稳定。（5）重复性试验。计算得各单糖含量的玆SD分别为鼠李糖（1.2%）、阿拉伯糖（1.3%）、木糖（2.1%）、甘露糖（1.3%）、葡萄糖（1.7%）和半乳糖（2.8%），表明该方法重复性良好。（6）加样回收试验。计算得各单糖的平均回收率（玭=6）（RSD）分别为鼠李糖101.3%（1.4%）、阿拉伯糖104.5%（1.1%）、木糖97.6%（2.9%）、甘露糖97.2%（2.1%）、葡萄糖101.5%（1.2%）及半乳糖103.3%（1.5%），表明该方法准确，可靠，可用于桑枝多糖中单糖的组成及含量测定。

注：A为混合对照品（standard）；B为样品（sample）。1为鼠李糖（Rhamnose）；2为阿拉伯糖（Arabinose）；3为木糖（Xylose）；4为甘露糖（Mannose）；5为葡萄糖（Glucose）；6为半乳糖（Galactose）。

图1 GC图谱

表1 各单糖的回归曲线、线性范围、相关系数

单糖 回归曲线 线性范围∥mg/ml 相关系数玆

鼠李糖 玒=35 284X-10 845 0.02~0.12 0.999 2

阿拉伯糖 Y=21 948X-13 126 0.02~0.12 0.999 6

木糖 Y=30 734X-12 691 0.02~0.12 0.999 3

甘露糖 Y=25 785X-11 420 0.02~0.12 0.999 4

葡萄糖 Y=28 583X-12 235 0.02~0.12 0.998 9

半乳糖 Y=31 673X-10 567 0.02~0.12 0.999 8

2.2 桑枝多糖中单糖的含量测定结果 根据保留时间及加标峰增高法，可确定新疆桑枝多糖由鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖及半乳糖组成。由各单糖的标准曲线计算出桑枝多糖中单糖的含量分别为鼠李糖（11.8 mg/ml）；阿拉伯糖（14.4 mg/ml）；木糖（1.6mg/ml）；甘露糖（1.9 ﹎g/ml）；葡萄糖（22.3 mg/ml）；半乳糖（28.0 mg/ml）。

3 结论与讨论

试验以浓度为4.0 mol/L的H2SO4、CCl3COOH、CF3COOH为水解液，以水解产物中的葡萄糖峰面积为参考指标，发现CF3COOH为水解液时，水解效果最好。同时，考察了不同浓度的CF3COOH（1.0、2.0、4.0、6.0 mol/L）水解桑枝多糖12 h，结果表明，4.0 mol/L CF3COOH水解桑糖枝多，葡萄糖峰面积最大，多糖水解的较彻底。以4.0 mol/L CF3COOH为水解液水解桑枝多糖2、4、6、8、10、12及24 h，结果发现水解2、4、6、8、10、12及24 h时，葡萄糖的峰面积分别为156 234、225 431、294 675、358 921、436 533、455 346及459 838，由此可见，水解12 h与24 h时，无多大区别，故试验选择4.0 mol/L的CF3COOH水解桑糖枝多糖12 h。

试验以水提醇沉法提取桑枝多糖，CF3COOH水解多糖，水解产物用盐酸羟胺、吡啶和醋酸酐衍生化，生成糖腈乙酸酯衍生物，气相色谱法测定桑枝多糖的单糖组成及含量。结果表明，该方法简便、灵敏、准确可靠，可用于桑枝多糖中单糖的组成及含量测定。

参考文献

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