杭州红茄离体再生体系研究

肖文斐 裘劼人 来文国 张 雅 郑桂珍 忻 雅 方献平 王淑珍

（杭州市农业科学研究院,浙江杭州 310024）お

摘要

［目的］探索适用于浙江茄子品种“杭州红茄”的高效离体再生的途径和方法。［方法］以杭州红茄的子叶、下胚轴和带腋芽茎段为试材，研究了该品种从愈伤诱导、分化、增殖到生根壮苗过程的离体再生体系，对不同时期的培养基及激素配比进行筛选比较。［结果］愈伤组织的诱导培养基以MS+6睟A 2.0 mg/L+IAA 0.1 mg/L效果较好，分化的理想培养基为MS+ZT 0.2 mg/L+IAA 0.1 mg/L, 而生根培养基以1/2MS+IAA 0.1 mg/L较适宜。［结论］该研究获得了高效的杭州红茄离体再生方法，为其基因工程的开展提供了技术支持。

关键词 茄子；杭州红茄；外植体；组织培养；再生体系

中图分类号 SB641.1文献标识码 A文章编号 0517-6611（2014）19-06159-03

お

Study on the Efficient Regeneration System of 玈olanum melongena 獿．Cultivar “Hangzhou Hongqie” 玦n vitro

XIAO Wen瞗ei et al

(Hangzhou Academy of Agricultural Sciences, Hangzhou, Zhejiang 310024)

Abstract ［Objective］ To explore the efficient regeneration system of “Hangzhou Hongqie” which is the local cultivar of 玈olanum melongena 獿 in Zhejiang. ［Method］ With the cotyledon, hypoeotyls and stem segments of “Hangzhou Hongqie” as explants, the regeneration system in vitro including callus induction, differentiation, proliferation and the rooting process was studied. The optimum mediums and hormone ratio in different periods were obtained. ［Result］ The results showed that the suitable medium for the callus induction was MS+ ZT 1.0 mg/L+ IAA 0.1 mg/L, and the ideal medium for differentiation was MS +6睟A 2.5 mg/L+ IAA 0.2 mg/L. On the other hand, the medium of 1/2MS + IBA 0.3 mg/L was better than MS for rooting. ［Conclusion］ High efficient regeneration system of “Hangzhou Hongqie” was established, which provide technical support for its genetic engineering.

Key words玈olanum melongena 獿; Hangzhou Hongqie; Explant; Tissue culture; Regeneration system

お

作者简介

肖文斐（1979-），女，湖南祁东人，助理研究员，博士，从事植物抗逆生物技术研究。

收稿日期 20140611

杭州红茄是浙江省的常规茄子品种，其果实细长均匀，果皮紫红鲜亮，皮薄肉白、质糯，食味鲜美，是杭州十大名菜之一。但该品种株型较矮，长势较弱，耐低温、耐高温能力较弱，制约其推广与生产［1-2］。利用转基因技术对其进行品种改良是一条经济有效的途径，建立高效的组织培养与植株再生体系是基因转化的前提和必要条件。

目前国内外有关茄子的组织培养和植株再生有过一些报道，主要从茄子的外植体器官再生、花粉(花药)培养、原生质体和小孢子培养等方面进行了研究，虽然取得了一些成就，但尚存在着研究不够系统和植株再生频率不高的问题［2-6］。而茄子不同品种间的再生能力及对培养基的要求差异很大［5-6］。笔者以杭州红茄为试材，探讨影响其离体再生的主要因素，以期建立适用于杭州红茄的高效再生体系，为其基因工程的开展奠定基础。

1材料与方法

1.1 材料

1.1.1

供试品种与外植体。供试品种为杭州红茄，种子购于杭州市三叶种子公司。选取室内培养的无菌幼苗的子叶、下胚轴及田间生长2个月左右的植株带腋芽茎段为外植体供试。

1.1.2

供试培养基。根据不同试验阶段和目的，以1/2MS培养基和MS培养基为基础培养基，添加不同植物生长调节激素和糖，配制相应培养基。pH为5.8，琼脂粉含量为7.5 g/L，121 ℃条件下灭菌20 min。

1.2方法

1.2.1

外植体的消毒处理。

1.2.1.1

室内无菌苗外植体消毒。种子消毒及无菌苗培养。精选的种子自来水浸泡过夜，55 ℃水浴处理10 min，75%乙醇表面消毒60 s后，20%次氯酸钠消毒20 min，灭菌水清洗4~5遍，接种于发芽培养基上（含0.8%琼脂的1/2MS培养基，不加蔗糖和激素），在25 ℃下每日光照16 h（光强为1 500 lx）的培养室内培育出无菌籽苗。从种子萌动开始算起，选14~16 d苗龄的幼苗，分别取其子叶、下胚轴为外植体进行组织培养。

1.2.1.2

田间苗外植体的消毒。选取健康无病的杭州红茄带腋芽茎段，于自来水下冲洗30 min，再用蒸馏水冲洗3遍，在超净台上将其修成0.5~1.0 cm长茎段，75%乙醇表面消毒60 s后，0.1%HgCl2消毒8 min，灭菌水清洗4~5遍。

1.2.2

愈伤组织诱导。将子叶、下胚轴、带腋芽茎段分别接种到含有不同激素组合的MS培养基上，筛选最适芽分化的培养基。取完全展开的子叶，去除叶尖及与叶片基部，切成1 cm×1 cm大小，在叶缘处横切数条小口，正面向上平铺接种于诱导培养基上。下胚轴分别切成0.5 cm左右的长段，竖直接在培养基上。带腋芽茎段切成0.5~1.0 cm左右的长段，芽头朝上接在培养基上。每个处理接种子叶50片、下胚轴30个、带腋芽茎段20个。

1.2.3

分化培养。

将愈伤接种于附加不同激素组合的MS培养基上，分别进行分化培养。2周左右继代1 次，4 周后统计结果。愈伤率(％)=(愈伤数/接种的外植体总数) ×100％；不定芽分化率(％)=(分化不定芽的外植体数/接种的外植体总数)×100％；不定芽分化系数=分化的不定芽总数/分化的外植体总数。

1.2.4

生根培养。当芽长至2~3 cm 时，分化出2~4片真叶时将其切下，转入生根培养基中，大约10 d后长出白色健壮的根系。

1.2.5

再生植株定植。

将生根的小苗室温炼苗2~3 d后从培养基中取出，洗净根上面的培养基，移栽到灭过菌的基质中，2~3周后就可移到室外定植培养。

2结果与分析

2.1 不同生长调节物质对愈伤形成的影响

采用MS为基本培养基，附加不同浓度的生长调节物质对杭州红茄3种类型外植体进行愈伤诱导试验。将外植体接种后，5~7 d后有愈伤开始产生。从表1可以看出，1~8号培养基均可以诱导上述外植体产生愈伤，但愈伤的诱导率及生长状态则有明显的差异。其中，6睟A低浓度下诱导率稍低，愈伤较少，而随着浓度的加大诱导率提高，愈伤较多；但高浓度（3 mg/L）时诱导的愈伤非常多，且容易玻璃化。0.2~2.0mg/L玉米素(ZT)的浓度均可以促进愈伤诱导，浓度增加愈伤化程度也相应加大；而8号培养基虽然可以诱导愈伤的产生，但生长状态较差，所以2,4睤在杭州红茄的愈伤诱导中不适用。供试的3种外植体中，下胚轴和子叶的诱导率较高，其中6睟A的培养基中下胚轴诱导率高于子叶，而ZT对子叶的诱导效果更优；腋芽茎段在各种培养基中的诱导率均低于前两者。综合考虑，2号培养基MS+6睟A 2.0mg/L+IAA 0.1mg/L的诱导效果最佳（图1），3种外植体的愈伤诱导率均在85%以上，愈伤生长状态也均较好。

表1不同生长调节物质组合对不同外植体愈伤诱导的影响

编号 激素浓度mg/L

诱导率∥%

子叶 下胚轴 腋芽茎段

愈伤生长情况

子叶 下胚轴 腋芽茎段

1 6睟A 1.0+ IAA 0.1 74.2±5.3 81.8±5.1 71.5±6.9 量少，黄白色，松软 量少，黄白色，松软 量少，浅黄带绿，松软

2 6睟A 2.0+ IAA 0.1 94.9±3.2 96.2±4.3 85.3±6.1 量较多，绿色，芽点较多，较紧实，团状量较多，黄绿色，芽点较多，致密 量较多，绿色，芽点较多，块状

36睟A 3.0+ IAA 0.191.5±7.897.4±4.483.8±5.6大量愈伤，中间绿色周围为半透明，块状，玻璃化量较多，发白，玻璃化大量愈伤，块状，半透明，玻璃化

4ZT 0.2+ IAA 0.179.3±7.576.9±5.870.1±9.3量中等，白中带绿，团状量少，白中带绿，致密量中等，绿色，芽点较多，团状

5ZT 0.5+ IAA 0.183.4±6.381.7±9.372.9±5.5量中等，淡黄绿色带芽点，较紧实，团状量中等，白中带绿，致密量较多，绿色带芽点，较致密，团状

6ZT 1.0+ IAA 0.194.4±4.992.8±7.476.2±5.6量较多，浅绿色芽点较多，团状，较紧实量较多，白中带绿色芽点，致密大量愈伤，块状，分化出许多绿色芽点

7ZT 2.0+ IAA 0.196.3±2.798.6±2.178.9±5.8大量愈伤，块状，中间绿色周围半透明，芽点多大量愈伤，淡黄绿色，致密大量愈伤，块状，中间绿色周围半透明，芽点多

8ZT 1.0+ 2,4睤 1.058.8±4.367.8±1.952.0±2.8黄褐色，松散，水渍状褐化，松散，水渍状褐化，松散，水渍状

图1 杭州红茄子叶在2号培养基上诱导的愈伤

表2 不同生长调节物质组合对不同外植体不定芽分化的影响

培养基け嗪 激素浓度mg/L 不定芽分化率∥%

子叶 下胚轴 腋芽茎段

1 6睟A 1.0+IAA 0.1 12.3±2.5 31.3±6.1 8.7±2.1

2 6睟A 2.0+IAA 0.1 17.3±4.2 36.7±4.0 13.3±3.5

3 6睟A 3.0+IAA 0.1 8.7±1.5 13.3±2.5 3.7±2.5

4 ZT 0.2+IAA 0.1 76.0±6.6 66.7±6.1 46.3±4.7

5 ZT 0.5+IAA 0.1 67.3±4.7 48.3±3.1 33.7±1.5

6 ZT 1.0+IAA 0.1 54.0±3.6 34.5±4.6 31.7±5.0

7 ZT 2.0+IAA 0.1 38.0±2.6 30.2±2.0 23.2±2.6

8 ZT 1.0+2,4睤 1.0 0 0 0

2.2 分化培养基的筛选

从表2可以看出，试验中所用的6睟A和ZT与0.1mg/L IAA组合均能诱导杭州红茄不定芽的分化。加入6睟A的培养基中2号培养基分化率最高；6睟A对3种类型外植体分化效果也不一样，下胚轴的分化效率最高，子叶其次，而腋芽茎段最低。而ZT对杭州红茄的分化效果明显优于6睟A，ZT浓度为0.2mg/L时最利于不定芽分化，随着ZT浓度的增加，分化率下降。ZT更能促进红茄子叶外植体分化为不定芽，下胚轴分化率稍低，腋芽茎段最低；8号培养基没有分化出芽。由此可见，MS+ZT 0.2 mg/L+IAA 0.1 mg/L是筛选出的最佳分化培养基（图2）。

图2 杭州红茄子叶在4号培养基上不定芽的分化

表3 不同培养基中的生根结果

培养基 生根率∥% 主根数 根长范围∥cm

MS 65.1±14.2 3.4±0.2 0.1~0.9

MS+0.1 mg/L IAA 71.8±12.9 3.9±0.4 0.1~0.9

1/2MS 85.3±5.6 4.2±0.5 0.1~1.5

1/2MS+ 0.1 mg/L IAA96.1±3.5 5.6±0.3 0.2~1.7

图3 1/2MS+0.1 mg/L IAA培养基上不定芽的生根

2.3 生根及壮苗

试验中共采用4种培养基，结果显示1/2MS生根效果明显优于MS培养基（表3），说明低离子浓度更利于杭州红茄生根；而加入0.1mg/L IAA可以促进根生长速度，提高生根率（图3）。这与洪晓华等报道较为一致［7］。

3小结与讨论

红茄种子经自来水浸泡过夜有利于种子吸胀，促进发芽整齐一致。茄子种子上常附有果肉，在发芽培养时容易污染，不利于无菌苗的培养。55 ℃热处理10 min，同时在培养基中不加蔗糖，则可以减少污染。种子发芽时用0.1%HgCl2灭菌效果较好，但对种子毒害大，严重影响种子萌发；而采用20%次氯酸钠消毒20 min对种子发芽率影响较小，同时有相对较低的污染率。而在对田间苗外植体消毒时，次氯酸钠效果很差，外植体污染率很高。0.1% HgCl2灭菌效果较好，消毒8 min时污染率较低，启动率较高;但随着灭菌时间的延长，外植体伤害大，启动率低。

6睟A和ZT是茄科植物组织培养中常用的生长调节物质，而在不同品种的茄子组培中最佳的诱导浓度不尽相

同［7-10］。而余波澜等研究发现加入低浓度的IAA可以促进

6睟A和ZT对芽分化的诱导率［8］，所以笔者在培养基中均加入了0.1mg/L IAA ，与不同浓度的6睟A或ZT组合应用。试验发现，1~3mg/L的6睟A与0.1mg/L IAA组合均能诱导杭州红茄产生愈伤并分化出不定芽，但高浓度6睟A会导致外植体愈伤组织玻璃化，不利于分化；而ZT浓度较高时，芽愈伤化过于强烈，后期也难以正常分化。洪晓华等分析表明2,4睤可以诱导茄子不定芽的分化［7］，但该试验表明其在杭州红茄的诱导分化中并不适用，这可能与品种差异有关。

不同外植体对不同生长调节物质诱导的反应不同，分化效果也不一样，这种现象在植物组织培养中较为常见［8，11］。该试验结果也证明了这一点。6睟A能较好地诱导杭州红茄下胚轴分化成苗，而ZT对子叶的分化效果较好，腋芽茎段则均为最低，可能是细胞分化程度不同导致其再生能力的差异。腋芽茎段在4号培养基中不定芽分化率也可以达46%，在无法取得子叶或下胚轴时，也可以考虑选用。而在选用植物激素时应该考虑所应用的外植体类型。

参考文献

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