颊粘膜拭子检测孤独症谱系障碍儿童相关基因多态性的临床应用

董睿 刘毅 赵冬梅 杨小萌 张艳卿 盖忠涛

颊粘膜拭子检测孤独症谱系障碍儿童相关基因多态性的临床应用

董睿*刘毅*赵冬梅△杨小萌*张艳卿△盖忠涛*△

目的探讨应用颊粘膜拭子采集样本以提取DNA进行孤独症谱系障碍（autismspectrumdisorder，ASD）相关基因检测的可行性。方法纳入41例ASD患儿。采用棉拭子擦拭患儿颊粘膜，酚-氯仿-异戊醇法抽提基因组DNA；另采集患儿外周静脉血，用试剂盒提取基因组DNA。比较两种取材方法获得的基因组DNA总量、浓度与纯度。应用PCR-限制性酶切法对亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetra-hydrofolate reductase，MTHFR）基因C677T位点进行基因型分析，比较两种取材法获得的基因分型结果一致性。结果从颊粘膜提取的基因组DNA总量[（5.87±2.58）μg vs.（2.00±0.92）μg]与浓度[（143.25±72.78）mg/L vs.（66.68±24.43）mg/ L]高于200µL血液提取的基因组DNA（P＜0.01），而纯度与血液样本比较差异无统计学意义（P＜0.05）。两种取材法进行MTHFR基因分型结果完全一致，并经Sanger测序验证。结论颊粘膜拭子是一种简单、无创、可靠的获取基因组DNA方法，可部分替代静脉血进行ASD相关基因多态性分析。

颊粘膜拭子 孤独症谱系障碍 基因组DNA 亚甲基四氢叶酸还原酶

孤独症谱系障碍（autismspectrumdisorder，ASD），是一组异质性神经发育障碍性疾病[1]。目前其病因研究主要集中在遗传学方面[2]。近期研究报道ASD发病与亚甲基四氢叶酸还原酶（methylenetetra-hydrofolate reductase，MTHFR）基因多态性有关，其C677T位点多态性增加ASD的发病风险[3]。但该方面的研究较少，更缺乏本地区的研究报道。从外周血提取基因组DNA是ASD病因研究的主要样本来源。但ASD好发年龄为0～3岁，且患者多伴语言交流障碍，基本不听指令，难以配合采血操作；此外，静脉取血为有创性操作，伴有一定的创伤与疼痛。因此，寻找一种操作简便、无痛无创的样本采集方法是ASD研究亟待解决的问题。本研究应用颊粘膜拭子擦拭ASD患儿的颊粘膜，然后提取基因组DNA，进行MTHFR基因C677T位点多态性检测，旨在验证此方法在ASD基因多态性研究中的可行性。

1 对象与方法

1.1 研究对象收集2013年8月至2013年12月在山东大学齐鲁儿童医院儿童保健所确诊并参加康复训练的ASD患儿。纳入标准：①年龄≤18岁；②根据《美国精神障碍诊断与统计手册第四版》（Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders,Fourth Edition，DSM-Ⅳ），由经验丰富的儿科正高级职称医师确诊为ASD。共纳入41例ASD患儿，其中男36例，女5例；年龄2.0～5.8岁，平均（3.50±0.83）岁。本研究方案经山东大学齐鲁儿童医院伦理委员会论证通过，所有样本采集均得到患儿父母或其他监护人的同意。

1.2 研究方法

1.2.1 采集颊粘膜样本并提取DNA 采集样本前患儿禁食1 h或生理盐水漱口，以避免食物残渣混入。采用一次性医用棉签（诸暨市康伟医疗卫生用品厂）擦拭患儿双侧颊粘膜至少5次。采集时动作轻柔，擦拭稍有力度，避免引起患儿不适及粘膜损伤。取材后将棉拭子置于1 mL生理盐水中洗涤，离心沉淀。应用传统的酚-氯仿-异戊醇法提取基因组DNA，以40µL TE缓冲液重溶。

1.2.2 采集外周血样本并提取DNA 抽取ASD患儿肘部静脉血1～2 mL，经EDTA抗凝，于-80℃冻存。应用血液基因组DNA提取试剂盒（北京天根生物技术公司），取200µL血液样本，参照试剂盒说明书，提取血液基因组DNA，最终获得40µL的基因组DNA洗脱液。

1.2.3 测定DNA浓度、纯度与总量 颊粘膜和血液样本基因组DNA提取后，应用核酸蛋白含量测定仪（EPENDOFF）和琼脂糖凝胶电泳测定其DNA总量、浓度和纯度。纯度用吸光度（260/280比值）表示。

颊粘膜和血液基因组DNA置于-20℃冻存，1个月后取出复测浓度及纯度，并行琼脂糖凝胶电泳查看片段有无断裂或降解。

1.2.4 PCR扩增DNA 以颊粘膜和血液样本基因组DNA为模板，检测MTHFR基因677位点单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP）。通过查阅文献和预实验，设计确定MTHFR基因C677T引物：上游，5’-GCC TCT CCT GAC TGT CAT CC-3’；下游，5’-CAC TCT CAC CGC ACC GTC CT-3’，扩增片段282bp。由上海英骏生物技术有限公司合成。PCR反应体系25µL：10×缓冲液2.5µL，0.2 mmol/L dNTP，上游引物和下游引物各2µmol/L，Taq酶0.2µL，模板DNA 1µL。基因扩增反应条件：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，65℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个循环，最后72℃延伸5 min。PCR产物用2.5%琼脂糖凝胶进行电泳。

1.2.5 限制性内切酶酶切PCR产物 MTHFR C677T基因型由限制性核酸内切酶HinfI（美国NEB公司）进行酶切。酶切体系10µL：HinfI内切酶1µL，10×H缓冲液1µL，PCR产物3µL。37℃水浴3 h，2.5%琼脂糖凝胶进行电泳，凝胶成像系统观察结果。

在内切酶Hinf I的作用下，MTHFR基因PCR产物C677T基因型可分为三种：野生型CC（长度为282 bp）、杂合突变型CT（长度分别为282 bp、176 bp和106 bp）和纯合突变型TT（长度分别为176 bp和106 bp）。

1.2.6 基因测序 随机抽取9例颊粘膜PCR产物，Sanger测序法测定PCR扩增片段的碱基序列（上海英骏生物技术有限公司），验证PCR-限制性酶切所得的基因型。

1.2.7 统计学方法 应用SPSS 17.0对数据进行分析。配对t检验比较两种取材法所得基因组DNA浓度、总量与纯度，以及冻存前后基因组DNA浓度、总量与纯度，并比较PCR-限制性酶切法与Sanger测序法所测MTHFR基因型是否一致。

2 结果

2.1 基因组DNA浓度、总量与纯度从颊粘膜细胞提取的基因组DNA与从血液提取的基因组DNA总量分别为（5.87±2.58）μg和（2.00±0.92）μg；浓度分别为（143.25±72.78）mg/L和（66.68±24.43）mg/L；纯度分别为（1.63±0.15）和（1.62±0.30）。

从颊粘膜细胞提取的基因组DNA总量（t= 6.37，P＜0.01）、浓度（t=6.37，P＜0.01）均高于从200 µL血液提取的基因组DNA，两者纯度比较差异无统计学意义（t=0.33，P=0.74）。颊粘膜细胞与血液提取的基因组DNA电泳结果示，两种取材所获DNA条带明亮清晰，大小一致，无明显差异。见图1。

复测冻存的颊粘膜和血液基因组DNA，浓度分别为（138.47±65.00）mg/L和（66.30±23.21）mg/L；纯度分别为（1.62±0.15）和（1.64±0.29）。与冻存前比较，颊粘膜样本浓度（t=1.19，P=0.24）、纯度（t＝0.82，P=0.42）和血液样本浓度（t=1.22，P=0.23）、纯度（t=0.07，P=0.94）均无明显差异，电泳也未见明显降解。

2.2 MTHFR C677T基因型在41例ASD患儿中，CC基因型表达者为9例，CT基因型26例，TT基因型6例，CT和TT为突变基因型，突变率为78.0%。见图2。

2.3 基因测序结果9例PCR产物进行基因测序，其结果与PCR-限制性内切酶酶切-电泳图谱基因分型结果完全一致。见图3。

3 讨论

早期家系和双生子研究证实，遗传因素在ASD发生中发挥重要作用[4]。近年来，已发现多种ASD相关易感基因，这些基因与环境因素相互作用，共同导致疾病发生。ASD等许多疾病的研究多采用外周静脉血中白细胞作为基因组DNA来源，但静脉采血存在多种弊端：首要的是采血给婴幼儿带来一定痛苦和伤害，多数家长对采血等有创操作存在抵触心理，且ASD患儿年龄段、症状表现特殊，极难配合采血操作，这给样本采集和重复取样带来很大难度[5]；在大样本的流行病学研究中，研究对象通常分散在全国，而静脉穿刺需要训练有素的工作人员，这使得收集血液样本非常困难。理论上说，任何有核细胞都可作为基因组DNA的来源。曾有研究比较口腔细胞刷、颊粘膜拭子、漱口等多种收集基因组DNA的方式，结果示从漱口水中提取的DNA产量相对最高[6]。但在实际操作中，ASD患儿年龄小，难以配合指令，因此漱口法不适合作为ASD遗传研究的DNA采集方法。国外有研究表明，颊粘膜拭子在人群中的接纳率为80%，明显高于血液（31%）和唾液（72%）采集的接纳率[7]。本研究也发现相对于采血，家长和患儿更易接纳采集颊粘膜样本。

图1 两种取材方法所获基因组DNA的电泳图A为部分患儿颊粘膜样本基因组DNA电泳图；B为相应血液样本基因组DNA电泳图

图2 两种取材方法所获基因组DNA样本PCR、酶切结果A为部分患儿颊粘膜样本酶切结果；B为相应血液样本酶切结果

图3 颊粘膜样本PCR产物测序结果A、B、C、D为正向测序结果；E、F为反向测序结果。其中A为基因型TT，B为基因型CT，C为基因型CT，D为基因型CT，E为基因型CT（反向测序结果AG），F为基因型为CT（反向测序结果AG）

健康人的口腔中有数百种微生物[8]，颊粘膜拭子采集的样本中含有相当数量的细菌、真菌或病毒。但Baechtel等[9]认为细菌和真菌并不干扰人类DNA模板的扩增反应。程家蓉等[10]通过实验证明食物也并不干扰人基因组DNA的扩增，该研究提取口腔、血液和人常食用的动植物（米饭、青菜、猪牛肉等）DNA，发现口腔、血液样本均能扩增出Alu、NAT2、GSTM1等基因片段，所有食物DNA全部未能扩增。本研究也表明，颊粘膜细胞基因组DNA扩增出的基因带型单一、清晰，未出现基因组DNA条带断裂、降解或非特异性条带等情况，其浓度明显优于从200 μL血液中提取的DNA，纯度与血液样本相当，说明从颊粘膜获得DNA是完全可行的。

本研究发现于-20℃冻存的颊粘膜、血液基因组DNA与新鲜提取的样本相比，浓度及纯度均无明显改变，电泳也未见明显降解情况。国内也有相似报道：通过颊粘膜拭子一次性采集的DNA，保存时间1个月时测DNA总量为1.0～1.5 μg，保存1年后测总量为0.8～1.3 μg，保存2年时约为0.7～1.3 μg[11]。这表明颊粘膜DNA同血液DNA一样可长期储存，而不影响基因组DNA质量与后期检测。应用PCR-限制性酶切法分析MTHFR基因C677T多态性，结果显示电泳条带清晰、明亮，基因型明确，且与血液基因组DNA的结果完全一致。有研究将颊粘膜拭子法应用在药物性耳聋基因、CHRNA3基因多态性分析中，均得到满意结果[12-13]。

综上，采集颊粘膜DNA相对于外周血具有简便、高效、廉价等诸多优点，被证实可用于ASD基因多态性等诸多研究，可有效地解决分子遗传学研究样本采集困难、反复取样受限等问题，具有较高的推广价值和普及价值。但在基因多态性位点研究以外领域，如核型分析、基因芯片等，颊粘膜DNA的应用尚处于空白阶段，仍需进一步探索。

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The application of buccal mucosa swab in analysis of gene polymorphismin children with ASD.

DONG Rui, LIU Yi,ZHAO Dongmei,YANG Xiaomeng,ZHANG Yanqing,GAI Zhongtao.Jinan Pediatric Research Institute and Key Laboratory of Pediatric Medicine,Jinan Pediatric Health Institute,Shandong Provincial AutismRehabilitation Center,Qilu Children’s Hospital of Shandong University,Jinan 250022,China.Tel：0531-81309011.

ObjectiveTo investigate the feasibility of buccal mucosa swab method to isolate genomic DNA for autismspectrumdisorders(ASD)-related genetic screening.MethodsBuccal mucosa swabs and blood were collected from41 children with ASD.Genomic DNA was extracted fromeither blood by using a commercial genomic DNA kit or buccal mucosa swab by using phenol-chloroform-isoamyl alcohol method.The concentration,total quality and purity of genomic DNA were compared between these two methods.Genotyping of the ASD-related methylenetetra-hydrofolate reductase (MTHFR)gene C677T locus was analyzed using PCR-restriction enzymatic digestion and sanger sequencing was performed forvalidation.ResultsThe total quality[(5.87±2.58)μg vs.(2.00±0.92)μg]and concentration[(143.25±72.78)mg/ L vs.(66.68±24.43)mg/L]of genomic DNA extracted frombuccal mucosa swab were higher than that formblood(P＜0.05), while the purity was not significantly different between these two methods(P＞0.05).Genotyping analysis of MTHFR was also consistent between these two methods.ConclusionBuccal mucosa swab is a simple,non-invasive and reliable method to obtain genomic DNA,which can partially rep lace blood for analysis of ASD-related gene polymorphisms.

Buccal mucosa swab Autismspectrumdisorder Genomic DNA MTHFR

R749.94

A

2014-03-04）

（责任编辑：肖雅妮）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.07.009

*山东大学齐鲁儿童医院儿童研究所（济南250022）

△山东大学齐鲁儿童医院，山东省孤独症儿童康复中心