丙酮酸盐对阿尔茨海默病大鼠学习记忆的影响☆

2014-04-27王晓楠胡雪君杨旸王斯琪

中国神经精神疾病杂志 2014年2期

王晓楠胡雪君杨旸王斯琪

王晓楠*胡雪君*杨旸*王斯琪*

目的研究丙酮酸盐对阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)模型大鼠学习记忆的影响并探讨其与海马神经细胞死亡的关系。方法将36只wistar大鼠随机分为空白对照组、AD模型组和丙酮酸盐治疗组，根据实验要求给药处理6周，同时观察各组大鼠一般情况，Morris水迷宫实验检测大鼠学习记忆能力，苏木精-伊红（hematoxylin and eosin,HE）染色检测海马神经细胞死亡，利用 2′,7′-dichlorodihydrofluorescein diacetate (H2DCF-DA)来检测海马CA1区内活性氧（reactive oxygen species,ROS）聚集情况。结果丙酮酸盐治疗组与AD模型组比较，一般情况均明显改善，逃避潜伏期均明显缩短(41.37±6.24,31.67±7.26,24.26±7.16,20.45±5.72, 19.36±5.89,均P＜0.05)；原平台象限活动时间明显增加(50.36±7.46 s,P＜0.05)，穿越原平台次数明显增多(3.98± 1.23次/2 min，P＜0.05)，海马CA1区锥体神经细胞死亡显著减少(P＜0.05)，海马神经细胞内ROS的水平也显著降低（P＜0.05）。结论丙酮酸盐可能通过降低海马组织内ROS的产生，减少海马神经细胞死亡，从而提高AD模型大鼠的学习记忆水平。

丙酮酸盐阿尔茨海默病学习记忆

阿尔茨海默病（Alzheimer′s disease，AD）是一种神经退行性疾病，以进行性记忆减退和认知功能障碍为主要临床症状，但AD的病因和发病机制复杂,目前AD的确切病因尚不清楚,许多病理过程参与其中,神经细胞外β-淀粉样蛋白(β-amy⁃loid，Aβ)沉积是AD的主要神经病理学特征之一[1]。可溶性Aβ寡聚体是导致神经元功能紊乱并最终导致AD记忆损伤的上游因素，其神经毒性的作用机制尚不明确，研究表明主要与Ca2+紊乱和氧化应激(活性氧ROS的产生)等密切相关[2-3]。丙酮酸盐可作为细胞保护剂，改善严重低血糖所致的神经细胞死亡和认知功能障碍[4-5],保护神经细胞拮抗β-淀粉样蛋白所致的神经细胞死亡[6]。为此，我们观测丙酮酸盐对AD大鼠模型认知功能和海马神经细胞的影响，旨在为AD的防治提供新的思路及有益的实验数据。

1 材料与方法

1.1 实验动物雄性Wistar大鼠，体重200～250 g，清洁级，由中国医科大学实验动物中心提供，适应性饲养1周后，经Morris水迷宫测试36只反应正常的大鼠，随机分为对照组（control）、AD模型组（AD）、和丙酮酸盐治疗组（AD+Py），每组l2只。

1.2 AD模型大鼠及用药方法除对照组外，将实验动物以3.6%水合氯醛腹腔注射（1 mL/100 g体重），麻醉后固定于脑立体定向仪上，按脑立体定位仪图谱，于AP-3.0 mm，ML±2.0 mm，DV4.0 mm，即为海马定位点，以微量注射器自脑表面垂直进针，在5 min内将1 μL Aβ1-42寡聚体（4 μg/μL）缓慢注入，留针5 min，缓慢退针，牙托粉填补针孔。所有操作均在无菌下进行，皮肤切开处用青霉素抗菌，缝合伤口。将大鼠放回笼中，单笼饲养至大鼠完全清醒，自由活动进食[7]。对照组在相同立体定位条件下，注射等体积PBS。术后1 d大鼠完全清醒，能自由活动进食后，丙酮酸盐治疗组给予干预治疗，每天腹膜注射丙酮酸钠500 mg/kg，对照组及AD模型组腹膜注射等渗NaCL注射液（104.5 mg/ kg），连续注射6周。在术后1周进行Morris水迷宫实验,以对照组大鼠逃避潜伏期均值的95%上限值为标准,将超出上限值者确定为痴呆大鼠[8]。

1.3 Morris水迷宫实验药物干预6周后，将每只大鼠头颈部毛发用普通染发剂涂黑，进行定位航行；测试时实验室温度在24～25℃，水迷宫中加入奶粉1 kg，用热水冲开，再用水加至高过安全平台1cm，水温保持现在22℃，左右。末次给药1 d后，采用Morris水迷宫定位航行和空间探索实验测定大鼠间学习记忆能力。其中定位航行试验历时5 d，每天4次，每次间隔20 min。第五天进行空间探索实验（即除去安全平台观察大鼠2分钟内在平台象限的游泳路程与总路程之比）。每次均3组平行进行。

1.4 海马神经细胞死亡的测定各组实验大鼠在最后一次进行Morris水迷宫测试后，各组分别取6只大鼠，常规灌注取材，制作石蜡切片，根据大鼠脑立位定位图谱选海马区附近连续切片12张，片厚4 μm，切片用PBS液漂洗2次，每次5 min，加入经苏木精染色15～30 min，用水冲洗3 h，然后加入伊红染色5 min，用乙醇分色。常规脱水、透明、封片，光镜下观察海马神经细胞形态变化。

1.5 海马神经细胞内活性氧（reactive oxygen spe⁃cies，ROS)聚集的测定各组实验大鼠在最后一次进行Morris水迷宫测试后，各组分别取6只大鼠，取出完整海马组织，利用2′,7′-dichlorodihy⁃drofluorescein diacetate (H2DCF-DA, Invitrogen, USA)来检测海马CA1区内ROS聚集情况[6]。

1.6 统计学方法采用SPSS17.0进行统计学处理，计量资料以表示，组间差异显著性检验采用单因素方差分析，组间两两比较采用Scheffe法，检验水准α=0.05。

2 结果

2.1 一般情况两周内各组无明显差异，但之后AD模型组大鼠逐渐出现行动和反应迟缓，饮食减少，体质量下降，并进行性加重；而丙酮酸盐治疗组上述情况均有改善。

2.2 Morris水迷宫检测如表1及表2所示，各组大鼠平均逃避潜伏期均日渐缩短，AD模型组与对照组比较逃避潜伏期明显延长(P＜0.05)，原平台象限活动时间明显减少(P＜0.05)，穿越原平台次数明显减少(P＜0.05)。丙酮酸盐治疗组与AD模型组比较：逃避潜伏期均明显缩短(P＜0.05)，原平台象限活动时间明显增加(P＜0.05)，穿越原平台次数明显增多(P＜0.05)。

表1 各组大鼠定向航行实验中每日平均逃避潜伏期(，s)

1）与对照组比较P＜0.05；2）与AD组比较P＜0.05

2.3 苏木精-伊红染色如图1所示，对照组大鼠海马CA1区锥体神经元形态正常；AD模型组大鼠CA1区锥体神经元排列紊乱，神经元肿胀或皱缩，染色质聚集，白质区组织疏松，有胶质细胞增生现象；丙酮酸盐治疗组大鼠海马CA1区锥体神经元形态正常。

2.4 海马神经细胞内ROS的聚集情况如图2所示，与对照组相比较AD模型组大鼠海马神经细胞内ROS的水平明显增高（P＜0.05），而丙酮酸盐治疗组大鼠海马神经细胞内ROS的水平未见明显变化（P＞0.05）。与AD模型组相比较，丙酮酸盐治疗组大鼠海马神经细胞内ROS的水平明显降低（P＜0.05）。

3 讨论

AD是一种神经退行性疾病，以进行性记忆减退和认知功能障碍为主要临床症状，但AD的病因和发病机制复杂,目前AD的确切病因尚不清楚,许多病理过程参与其中,神经细胞外β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积是AD的主要神经病理学特征之一[1]。AD的发病机制研究,近十年的主导假说是Aβ毒性学说,尤其是可溶性Aβ寡聚体的神经毒性作用日益被重视[9-11]。可溶性Aβ寡聚体的神经毒性远强于其他不可溶性类淀粉样蛋白，AD病情严重程度和突触缺失程度与Aβ总量相关，但非线性关系，而与可溶性Aβ寡聚体呈线性相关。本研究利用Aβ1-42寡聚体海马内注射制作AD大鼠模型。Aβ寡聚体是导致神经元功能紊乱并最终导致AD记忆损伤的上游因素，其神经毒性的作用机制尚不明确，研究表明主要与Ca2+紊乱和氧化应激(活性氧ROS的产生)等密切相关[3,12]。随着对Aβ寡聚体在AD形成和发展中的认识和研究的不断深入，靶向Aβ寡聚体的治疗策略将成为AD治疗中的重要途径之一，有望很快进入临床应用。与以往治疗策略不同，Aβ寡聚体靶向治疗不仅改善AD早期症状，而且可能减缓或减轻症状的恶化程度。

表2 各组大鼠空间探索试验中原平台象限活动时间和穿越原平台次数

图1 各组大鼠海马组织CA1区的HE染色（400×）

图2 各组大鼠海马神经细胞内ROS的聚集情况 *与对照组比较P＜0.05；△与AD组比较P＜0.05

外源性的丙酮酸盐（pyruvate）在体内转化为丙酮酸根阴离子和（或）丙酮酸起作用。丙酮酸是体内糖酵解的中间产物，位于无氧酵解和有氧氧化代谢交接处，属α-酮酸，是三大营养物质代谢的枢纽，其分子量小，可通过血脑屏障，经单羧酸转运体自由进出细胞和线粒体，为丙酮酸盐在体内作用提供保障。丙酮酸盐不仅可作为三羧酸循环的底物产生腺苷三磷酸（ATP）为组织正常生理结构功能的维持提供能量，还可作为细胞保护剂，保护神经细胞拮抗谷氨酸盐所致的神经毒性作用[13]并抑制鼠体内氧自由基的氧化作用[14]。丙酮酸盐主要通过两种机制起到抗氧化作用：其一，可直接通过非酶促的去碳酸基反应抑制过氧化氢；其二，补充丙酮酸盐，可增强柠檬酸循环，柠檬酸产生增多后，抑制磷酸果糖激酶，从而进入磷酸戊糖旁路，产生还原型辅酶II（NADPH），从而间接地增加谷胱甘肽（GSH）抗氧化能力。丙酮酸盐还可增加辅酶I/还原型辅酶I（NAD+/NADH）的比值，促进三羧酸循环反应。

本研究发现AD模型组逃避潜伏期明显延长，原平台象限活动时间和穿越原平台次数明显减少，且大鼠海马组织内ROS的产生及CA1区锥体细胞的死亡显著升高。同时发现丙酮酸盐预处理实验组一般情况较AD模型组明显改善，逃避潜伏期明显缩短，原平台象限活动时间和穿越原平台次数明显增加，大鼠海马组织内ROS的产生及CA1区锥体细胞的死亡显著减少，说明丙酮酸盐有效地改善了AD模型大鼠的学习记忆水平。由此我们推测丙酮酸盐一方面可能通过逆转Aβ寡聚体介导的Ca2+/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）自动磷酸化水平的抑制来阻止Aβ寡聚体诱导的长时程增强（LTP）抑制，从而改善学习和记忆的损害；另一方面可能通过维持细胞内ATP水平及NAD+水平来拮抗Aβ寡聚体诱导的海马神经细胞死亡，从而延缓AD进展；丙酮酸盐的抗氧化作用可能是丙酮酸盐神经保护作用的上游机制，但这一假说有待进一步研究证实。

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Effects of pyruvate on learning and memory in a rat model of Alzheimer’s disease.

WANG Xiaonan,HU Xue⁃jun,YANG Yang,WANG Siqi.

Departments of Respiratory and Infectious disease,the First affiliated Hospital of China Med⁃ical University,Shengyang,110001,China.Tel:024-83283770.

ObjectiveTo study the effects of pyruvate on learning,memory and neuronal cell death of the hippo⁃campus in a rat model of Alzheimer’s disease(AD).MethodsA total of 36 rats were randomly divided into control group,AD model group，and pyruvate group.General condition was observed after 6-week dipsacus treatment．Morris water maze was used to determine 1earning and memory in animals.Hematoxylin and eosin(H-E)staining was used to quantify neuronal death in the hippocampus.The reactive oxygen species(ROS)was assessed by using 2′,7′-dichlorodi⁃hydrofluorescein diacetate(H2DCF-DA).ResultsCompared with AD model group,pyruvate group showed improved gen⁃eral condition,shortened escape latency(41.37±6.24,31.67±7.26,24.26±7.16,20.45±5.72,19.36±5.89，respectively P＜0.05),increased activity time on the former platform quadrant(50.36±7.46 s,P＜0.05),increased number of crossing the former platform(3.98±1.23 time/2 min，P＜0.05),reduced ROS levels and decreased neuronal cell death in CA1 of the hippocampus decreased(respectively,P＜0.05).Conclusions Pyruvate can improve the learning and memory and de⁃crease the neuronal cell death through preventing the ROS production in AD rats.

Pyruvate Alzheimer’s disease Learning and memory

2013-08-02）

（责任编辑:李立）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.02.006

☆ 国家自然科学基金资助项目（编号：81200246），高等学校博士学科点专项科研基金（编号：20122104120004），辽宁省自然科学基金项目(编号：2013010025-401)

* 中国医科大学附属第一医院呼吸感染科（沈阳110001）