益气通便颗粒微生物限度检查法研究

王洪水

(马应龙药业集团股份有限公司，湖北 武汉 430064)



益气通便颗粒微生物限度检查法研究

王洪水

(马应龙药业集团股份有限公司，湖北 武汉 430064)

目的：建立益气通便颗粒微生物限度检验方法。方法：按《中国药典》2010版附录微生物限度检查法的验证试验指导原则，采用培养基稀释法和常规法对三个批号的益气通便颗粒进行微生物限度测定。结果：各菌种的回收率均大于70%，在控制菌常规法验证中实验组检出试验菌；通过方法学验证表明，细菌、霉菌及酵母菌检查可采用培养基稀释法检验，控制菌可采用常规法进行检验。结论：建立的益气通便颗粒微生物限度检验方法准确可靠、可行性强，能有效地对其进行微生物限度的测定。

益气通便颗粒；常规法；培养基稀释法；方法验证

益气通便颗粒为口服给药制剂，由何首乌、枳壳、升麻、火麻仁、白术、炙黄芪、肉苁蓉等七味中药组成，具有益气养阴、润肠通便之功效。用于中老年气阴两虚、气机升降失常、肠道失运引起的便秘，症见大便干结，或大便稀软难解，肛门坠胀，努挣无力，便后疲惫，舌淡胖而少津，或舌红少苔，脉虚无力，或细涩无力。为了有效地对益气通便颗粒进行微生物限度测定，准确检出样品中存活的微生物数量及致病菌种类[1-3],特研究了其微生物限度的检查方法并进行了方法验证。

1 实验仪器、试药

1.1 实验菌种

白色念珠菌CMCC(F)98001、金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003、枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501、黑曲霉CMCC(F)98003、大肠埃希菌CMCC(B)44102由中国食品药品检定研究院提供。

1.2 样品

益气通便颗粒(马应龙药业有限公司，批号：120601、131001、131101)。

1.3 培养基

玫瑰红钠琼脂培养基(BR 021011)、MUG培养基、营养肉汤培养基(BR)、曙红亚甲蓝琼脂培养基(EMB)(伊红美蓝琼脂培养基)、营养琼脂培养基(BR)、改良马丁培养基(BR)、胆盐乳糖培养基(BL)、pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液(OWD-M0151)以及0.9%无菌氯化钠溶液等。

1.4 仪器

天平、培养箱、冰箱、微波炉、高压灭菌锅等。

2 方法与结果

2.1 菌液制备

①取经35℃培养24h的大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌的营养肉汤培养物1mL，加适量0.9%无菌NaCl溶液制成细菌数为50～100cfu/mL的菌液，做活菌计数备用。②取经25℃培养24h以改良马丁培养基培养的白色念珠菌液体培养物1mL，加适量0.9%无菌NaCl溶液制成细菌数为50～100cfu/mL的菌液，做活菌计数备用。③将黑曲霉的新鲜培养物接种到斜面改良马丁琼脂培养基上，经25℃培养1周，加5mL0.9%无菌NaCl溶液洗下斜面的霉菌孢子，然后吸取洗下的孢子液用适量0.9%无菌NaCl溶液制成细菌数为50～100cfu/mL的菌液，备用。

2.2 供试液的制备方法

取样品10g研碎，加入适量pH7.0的无菌NaCl-蛋白胨缓冲液使溶解并稀释至100mL，制成1∶10的供试液备用；取以上供试液1mL注皿。常规法，取1∶10的供试液1mL注皿；培养基稀释法，取1∶10的供试液1mL注入5个平皿中。

2.3 回收率试验

菌液组：取上述各菌液1mL分别注入平皿中，立即注入琼脂，待凝固后，细菌35℃培养72h，白色念珠菌、黑曲霉25℃培养120h；平行制备2个平皿，测定各菌株的实验菌数。

试验组：取上述供试液和不同菌液各1mL分别注入同一平皿中，平行制备2个平皿。立即注入琼脂，待凝固后，细菌35℃培养72h，白色念珠菌、黑曲霉25℃培养120h；平行制备2个平皿，测定各菌株的实验菌数。

供试品对照组：取上述供试液1mL注入平皿中，立即注入琼脂，待凝固后，细菌35℃培养72h，白色念珠菌、黑曲霉25℃培养120h；平行制备2个平皿，测定供试品本底菌数。

稀释剂对照组：取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液1mL和上述不同菌液1mL，分别注入同一平皿中，立即注入琼脂，待凝固后，细菌35℃培养72h，白色念珠菌、黑曲霉25℃培养120h；平行制备2个平皿，考察稀释剂对试验有无干扰。该对照组各试验菌的回收菌应不低于70%。

2.4 验证方法

2.4.1 常规法 取3个批号的益气通便颗粒，按常规法测定每一株菌的实验菌数，并分别计算各试验菌的回收率。结果表明，大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌和白色念珠菌和黑曲霉回收率均大于70%，而金黄色葡萄球菌回收率小于70%[4]，表明益气通便颗粒对细菌的生长有一定的抑制作用。对霉菌和酵母菌的生长无抑制作用，可采用常规法进行霉菌和酵母菌测定，采用常规法进行细菌数测定检验不可行。pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液作为稀释剂对照组回收率超过70%，表明稀释剂无抑菌作用，对实验应无干扰。结果见表1。

表1 细菌、霉菌及酵母菌的计数方法常规法验证结果的回收率 (cfu/mL)

2.4.2 培养基稀释法 根据常规法预试验结果显示，益气通便颗粒对细菌有一定的抑制作用，采用培养基稀释法(0.2mL/皿)进行进一步试验[5-6]。结果表明，金黄色葡萄球菌采用培养基稀释法回收率为75%，大于70%，表明经采用培养基稀释法(0.2mL/皿)能有效消除益气通便颗粒对细菌的抑制作用，采用培养基稀释法(0.2mL/皿)进行细菌计数测定应可行。结果见表2。

表2 细菌、霉菌及酵母菌的计数方法培养基稀释法验证结果的回收率 (cfu/mL)

根据上述实验，初步确定益气通便颗粒细菌计数方法为培养基稀释法(0.2mL/皿)，霉菌和酵母菌计数方法为常规法。

2.4.3 控制菌检查方法的验证[7]试验组：分别取上述供试液10mL、大肠埃希菌1mL接种到同一100mL的胆盐乳糖培养基中，移至35℃培养24h左右，取以上培养物0.2mL接种到5mLMUG培养基上，于366nm紫外灯下分别在5h、24h观察荧光；然后进行靛基质试验。另取培养物接种于曙红亚甲蓝琼脂培养基上，至35℃培养18～24h，观察菌落形态。试验结果见表3。

阴性对照组：取上述制好备用的金黄色葡萄球菌1mL接种到100mL的胆盐乳糖培养基中，方法同试验组进行检查。

表3 控制菌的验证结果

结果表明按常规法检查，益气通便颗粒对大肠埃希菌的生长无抑制作用，可采用常规法进行控制菌的检查。

根据上述实验结果，益气通便颗粒微生物限度检查方法可为：

微生物限度：照微生物限度检查法(中国药典2010版一部附录ⅩⅢC)取本品10g，加pH7.0无菌氯化钠—蛋白胨缓冲液稀释至100mL，混匀，作为1∶10的供试液。

细菌数：取1∶10的供试液1mL注入5个平皿中，平行制备10个平皿，按平皿法测定。

霉菌和酵母菌数：取1∶10的供试液1mL注入1平皿中，平行制备2平皿，按平皿法测定。

大肠埃希菌:取1∶10的供试液10mL加入100mL胆酸乳糖培养基中，低度法检查。

细菌数每1g不得超过1 000cfu，霉菌和酵母菌数每1g不得超过100cfu，大肠埃希菌每1g不得检出。

3 讨论

益气通便颗粒对细菌有一定的抑制作用，采用常规法不能有效消除益气通便颗粒对细菌的抑制作用，需进一步采用培养基稀释法进行验证；通过方法学验证，本品的细菌、霉菌及酵母菌检查可采用培养基稀释法检验，控制菌可采用常规法进行检验；另本品对大肠埃希菌无抑菌作用，故控制菌可采用常规法进行检验。通过以上微生物限度检验方法的研究，建立了合理可行的检验方法，为微生物限度检测方法的建立提供了有利的依据。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典(一部)[S].北京：中国医药科技出版社,2010：附录ⅧC79-88.

[2] 中国食品药品检定研究院．中国药品检验标准操作规范[M].北京：北京中医药科技出版社,2005:362-403.

[3] 蒋小云，张先文，陶俊钰．感冒退热颗粒微生物限度检查方法学验证[J]．安徽医药，2008,12(2)：123-125．

[4] 阚秀燕,李妍.4 种中成药微生物限度检查法中细菌霉菌(酵母菌)计数的方法验证[J].中华中医药学刊,2007(11):14-16.

[5] 刘雅清．板车消炎颗粒微生物限度检查法的验证[J]．中国实用医药，2011，6(4)，267-268 ．

[6] 詹云丽.对影响微生物限度检查结果若干因素的探讨[J].中国药师,2003,6(6):21-23.

[7] 王知坚,邵惠琴,杜芸,等.药品微生物限度检查法有效性验证实验研究[J].中国现代应用药学,2004,21(3):211-213.

(责任编辑：李岚春)

Study on the Method of Microbial Limit Test of Yiqitongbian Grain

Wang Hongshui

(Wuhan Mayinglong Pharmaceutical Group Stock Co.,LTD，Hubei 430064)

Objective:To establish the method of microbial limit test of Yiqitongbian grain.Methods:According to theChinaPharmacopoeia2010 Edition appendix of microbial limit test method test guideline,use the culture medium dilution method and the routine method to determine the microbial limits of Yiqitongbian grain.Results:The recovery of the strain rate was more than 70%,the experimental group were verified by test bacteria in the control bacterium of conventional method;by method validation indicated that bacteria,mil-dew and yeast inspection,medium dilution can be used to control bacteria,mildew and yeast′s inspection of bacteria test,the routine method can be used to check Controling bacteria.Conclusion:The established Yiqitongbian grain of microbial limit test method is accurate,reliable,feasible,and can carry out the measurement of microbial limit for its effective.

Yiqitongbian Grain; The Routine Method; Culture Medium Dilution Method; Method Validation

2014-01-21

王洪水(1971-)，男，湖北马应龙药业集团股份有限公司工程师、执业药师，研究方向为中药提取。

R284

A

1673-2197(2014)08-0037-02