菱角啤酒发酵条件的研究

梁宝东，魏海香 *，刘 静，杨永涛，李 俏，牛汉刚

（1.济宁学院 生命科学与工程系，山东 曲阜 273155；2.西南大学 生命科学学院，重庆 400715）

菱角（Trapa bicornis）又名水栗、菱实，是一年生草本水生植物菱的果实[1]。菱角味甘、性寒，无毒，含有丰富的淀粉、蛋白质、葡萄糖、不饱和脂肪酸、多种维生素及人体必需的氨基酸，矿物质元素和黄酮类化合物含量也较高。黄酮类化合物能有效改善脑血管功能和血液循环，对防治高血压、动脉硬化、心血管系统疾病有显著的疗效[2]。天然、营养、保健的菱角啤酒具有很大的开发利用价值和良好的经济效益和社会效益[3]。本实验在先前初步研究的菱角啤酒的基础上[4]，为降低菱角啤酒的酒精度，更加适应市场的需要，进一步研究其发酵条件，为菱角保健啤酒的工业化生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

啤酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）APV：郑州雅大集团有限公司；菱角：市售；啤酒花：烟台杰诺生物酶有限公司；大麦芽：曲阜三孔金丰麦芽有限公司；α-淀粉酶、糖化酶：枣庄杰诺生物酶有限公司；CaCl2（分析纯）：天津市大茂化学试剂厂；3,5-二硝基水杨酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

T6紫外分光光度计：北京普析通用仪器有限公司；BL-100高速多功能粉碎机：浙江省永康市松青五金工具厂；TDL-60B台式离心机：上海安亭科学仪器厂；YXQ-LS-75SⅡ立式压力蒸汽灭菌锅：上海博讯实业有限公司；FA2004N电子分析天平：上海精密仪器有限公司；LY-0.2A/200啤酒酿制设备：山东良友设备有限公司；FCD-2000智能型恒温鼓风干燥箱：上海琅玕试验设备有限公司；PHS-25pH计：上海精密仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菱角啤酒制备工艺流程[4]

1.3.2 工艺操作要点

菱角汁的制备：用干磨机将脱壳干菱角粉碎，过300目筛，配成质量浓度为20%的菱角粉浆，加入0.2%的CaCl2作为保护剂，用乳酸调整pH值为6.0，以30 U/g干物质加入耐高温α-淀粉酶，在95 ℃液化80 min。液化结束，冷却至60 ℃，用乳酸调整pH值为5.0，以150 U/g干物质加入糖化酶，60 ℃糖化2.5 h。菱角汁在85 ℃条件下保持10 min灭酶。快速滤纸进行过滤，得到澄清的菱角汁。

麦芽汁的制备[5-7]：大米与麦芽按1∶3配料。将大米粉碎，过40目筛，细粉超过其质量的70%，按1∶5加水，45 ℃保持10 min，升温至90 ℃保持20 min，煮沸20 min，备用。麦芽粉碎，皮壳破而不烂，37 ℃保持20 min，升温至50 ℃保持60 min后升温至65 ℃，加入大米液糖化至碘液反应完全，升温至78 ℃，过滤。调整麦芽汁浓度为12°Bx，用乳酸调整pH值为5.2～5.4。麦汁煮沸过程中添加酒花0.08%，煮沸时间为90 min，过滤。

发酵：采用低温发酵工艺[8-9]，按照试验方案，将麦芽汁和菱角汁加入发酵罐，接种酵母泥，进行主发酵和后酵，在发酵过程中，定时取样，测量相关工艺参数变化[10]。

1.3.3 理化指标检测

氨基酸态氮测定采用甲醛滴定法[11]；pH值测定采用pH计；酒精度测定采用密度瓶法；糖度、原麦汁浓度采用密度瓶法；苦味值采用比色法；泡持性测定采用秒表法；双乙酰测定采用紫外分光光度法[12]；酵母菌数测定采用血球计数板计数[13]；还原糖含量测定采用3,5-二硝基水杨酸法[14-15]。

1.3.4 菱角啤酒感官评价标准

菱角啤酒感官评价标准（满分100分）见表1。

表1 菱角啤酒感官评分标准Table 1 Sensory evaluation standard of water chestnut beer

2 结果与分析

2.1 酵母菌接种量对菱角啤酒酒精度和还原糖含量的影响

设置酵母菌的接种量为0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%，菱角汁的添加量为20%，主酵时间6 d，主酵温度10 ℃，后酵时间13 d，后酵温度4 ℃。检测发酵液中还原糖下降曲线和酒精度的变化趋势，结果见图1，并进行感官评价。

由图1可知，发酵液的还原糖降低速率随酵母菌接种量的增加而增加，酒精度随接种量的增加而增加，当酵母菌的接种量为0.1%时，发酵结束后残糖含量较高，酒精度偏低；当酵母菌的接种量为0.9%时，还原糖下降速率快，发酵的高泡期提前，当酵母菌的接种量为0.5%时，残糖含量和酒精度都比较适中。主酵2～3 d时泡沫最丰富，主酵第4天还原糖含量就达到后酵要求的4.5 g/100 mL左右，后酵时酵母菌数≥7×106CFU/mL，有利于啤酒的成熟[8]。

主酵后期酵母菌提前沉降，影响后期还原糖的继续发酵。在感官评定方面，酵母添加量为0.1%时，有明显的甜味，口感不清爽；酵母添加量为0.9%时，啤酒缺少醇厚感，口味较淡薄，啤酒杀口力差。接种量为0.5%时，口味较柔和，杀口力强。综合理化指标和感官评定，酵母菌的接种量为0.5%时菱角啤酒的发酵条件最佳。

2.2 菱角汁添加量对菱角啤酒酒精度和还原糖的影响

设置菱角汁的添加量为10%、15%、20%、25%、30%，酵母菌的添加量为0.5%，主酵时间6 d，主酵温度10 ℃，后酵时间13 d，后酵温度4 ℃。检测发酵液中还原糖和酒精度的变化曲线，结果见图2，并对啤酒进行感官评价。

图2 菱角汁添加量对菱角啤酒还原糖含量（A）和酒精度变化（B）的影响Fig.2 Effect of water chestnut juice addition on reducing sugar content (A) and alcohol content (B) in water chestnut beer

由图2可知，菱角汁添加量越大，发酵初期发酵液糖度越低，且菱角汁的添加能降低发酵过程中的还原糖降低速率。在相同时间段，菱角汁添加量越大，酒精度越低，影响酵母菌的乙醇代谢。当菱角汁的添加量为15%～20%，进入后酵时，发酵液的还原糖含量在4.5 g/100 mL左右，酒精度在1.54%vol～1.90%vol。菱角汁添加量≥20%时，还原糖下降速率慢，酒精度较低，影响啤酒的品质。

在感官评定方面，菱角汁添加量越大，泡沫越丰富，啤酒的苦味越重。不添加菱角汁的啤酒，入口清香，持久性较差；菱角汁添加量为10%～15%，菱角啤酒苦味较淡，清澈透明，无沉淀物；菱角汁添加量为20%，菱角啤酒的苦味适宜，爽口，口感醇厚，在口中的持久力强；菱角汁添加量为25%～30%，菱角啤酒苦味较重，口感差，沉淀物较多。综合理化指标和感官评定，菱角汁的添加量为20%时菱角啤酒的发酵条件最佳。

2.3 主酵时间对菱角啤酒还原糖和酒精度的影响

设置主酵时间为4 d、5 d、6 d、7 d、8 d，酵母菌添加量为0.5%，菱角汁添加量为20%，主酵温度10 ℃，后酵时间13 d，后酵温度4 ℃。检测发酵液中还原糖和酒精度的变化曲线，并对啤酒进行感官鉴定，确定最佳主酵时间。在此过程中，控制酵母接种的时间不同，主酵时间长的提前接种，使它们同时进入后酵。不同主酵时间对发酵液中还原糖和酒精度变化的影响见图3。

图3 主酵时间对菱角啤酒还原糖含量和酒精度的影响Fig.3 Effect of main fermentation time on reducing sugar and alcohol content in water chestnut beer

由图3可知，啤酒在发酵过程中，接种12 h后进入发酵的低泡期，发酵液开始产生泡沫，还原糖降低速率较慢。3～4 d为发酵高泡期，泡沫丰富，糖降低速率快。主发酵第5天进入落泡期，糖降速率有所降低，当还原糖含量降到4.5 g/100 mL时，降温进入后酵，减缓酵母菌的沉降速率。当主酵时间到第6天时，还原糖含量＜4.5 g/100 mL，此时进入后酵，减缓酵母菌沉降的速率，有利于糖的进一步分解和双乙酰的还原。主酵时间＜6 d时，进入后酵时的残糖含量较高，发酵液最后的残糖含量高，酒精度较低，影响啤酒的口味；主酵时间较长时，酵母菌沉降速率快，不利于双乙酰的还原。

在感官评定方面，主酵时间为4 d时，啤酒甜味较重，口感不爽口；主酵时间为6 d时，口感清爽，无异味；主酵时间为8 d时，啤酒有酸败味，可能是由于主酵时间长，双乙酰峰值延后，后期双乙酰还原不彻底造成的。综合理化指标和感官评定，主酵时间为6 d时菱角啤酒的条件最佳。

2.4 后酵时间对菱角啤酒还原糖和酒精度的影响

图4 后酵时间对菱角啤酒还原糖含量和酒精度的影响Fig.4 Effect of post-fermentation time on reducing sugar and alcohol content in water chestnut beer

设置后酵时间为9 d、11 d、13 d、15 d、17 d，酵母菌添加量为0.5%，菱角汁添加量为20%，主酵时间6 d，主酵温度10 ℃，后酵温度4 ℃。检测还原糖下降曲线和酒精度的变化曲线，结果见图4，并对啤酒进行感官评价，确定最佳后酵时间。

由图4可知，发酵液进入后酵，酵母菌沉降，发酵液泡沫减少，还原糖下降缓慢。后酵13 d后还原糖、酒精度基本平稳，镜检发现发酵液中的酵母数很少。因此，菱角啤酒发酵的后酵时间13 d为宜，周期太长，生产成本增加。

2.5 啤酒中理化指标的变化

综上所述，菱角啤酒的最优发酵条件为：酵母接种量0.5%，菱角汁添加量20%，主酵时间6 d，后酵时间13 d。在此条件下进行菱角啤酒发酵，检测发酵液中还原糖，酒精度，双乙酰的变化，并与不加菱角汁的啤酒中3种物质的含量进行对比，其变化曲线见图5。

图5 啤酒中酒精度、还原糖、双乙酰的变化趋势Fig.5 Change of alcohol,reducing sugar and diacetyl content in water chestnut beer

由图5可知，添加菱角汁的啤酒初始还原糖含量低，在发酵过程中糖降速率小，还原糖在主酵3～6 d时下降速率快。发酵结束时添加菱角汁的啤酒中还原糖的含量高于不添加菱角汁的啤酒。随着发酵时间的增加，啤酒中双乙酰含量先增大后逐渐降低，且菱角啤酒的双乙酰含量低，口感清爽。酒精主要是在主酵中后期和后酵前期产生，后酵后期酒精度变化平稳。综上所述，添加菱角汁啤酒初始还原糖的含量低，发酵结束时的还原糖含量高，酒精度较低，双乙酰含量略低，菱角中的某些成分可能影响酵母菌的代谢，有待进一步证实。

2.6 产品质量指标

2.6.1 菱角啤酒感官指标

清澈透明，无明显的悬浮物和沉淀物；起泡性好，泡沫细腻，持续时间长，挂杯持久。具有明显的菱角味，有酒花香；菱角啤酒口感爽口，苦味值大，杀口力强，无异杂味。

2.6.2 菱角啤酒理化指标

以不加菱角汁的啤酒作为对照，菱角啤酒检测的理化指标结果见表2。

表2 菱角啤酒的理化指标Table 2 Physicochemical indexes of water chestnut beer

2.6.3 菱角啤酒卫生指标

菌落总数＜50 CFU/mL；大肠杆菌数＜3 MPN/100mL，卫生指标符合GB2758—2012《发酵酒及其配制酒》规定标准。

3 结论

菱角啤酒的最优发酵条件为：酵母接种量0.5%，菱角汁添加量20%，主酵时间6 d，后酵时间13 d。在此条件下，啤酒中还原糖残留量为1.63 g/100 mL，酒精度达3.52%vol，双乙酰含量为0.06 mg/L。酿制的啤酒清澈透明，呈琥珀色，无沉淀物。泡沫丰富细腻，持久性长。口感清爽，苦味协调，品质良好，理化及卫生指标符合国家标准。

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