GC-MS对非酿酒酵母菌发酵赤霞珠葡萄酒香气成分的检测

徐亚男，刘秋萍，李 琦，王 月，单春会，肖 婧，史学伟*

（石河子大学 食品学院，新疆 石河子 832000）

葡萄酒发酵前期存在大量非酿酒酵母[1]，与酿酒酵母相比，非酿酒酵母能产生和分泌多种胞外酶[2]：胶质酶可增加葡萄汁的提取，促进酒的澄清；β-葡萄糖苷酶是水解的非挥发性的糖苷香气物质前体；蛋白酶能增加澄清；酯酶是重要的发酵香气成分；脂肪酶能分解葡萄酒中或酵母自溶的脂肪。这些酶与葡萄汁相互作用，产生不同的品种和发酵香气[3]。国内研究非酿酒酵母对葡萄酒香气成分影响的报道较少[4]。此外，在我国还未形成利用芳香成分作为评价葡萄酒质量的系统[5]。随着科学技术的发展，香气成分鉴定技术趋于成熟，芳香成分将成为葡萄酒评价的一个重要组成部分。因此，准确的分析检测葡萄酒中各种香气物质组成对葡萄酒感官特点的改善及酿造工艺的控制具有积极的意义。

本实验室前期在新疆葡萄自然发酵过程中采集大量酵母菌，通过26S rRNA测序得到19株非酿酒酵母菌，选择其中发酵能力较强的7株与工业菌株混合发酵新疆赤霞珠干红葡萄酒，对其香气成分进行气相色谱-质谱（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）分析，以期确定该品系的香气特点、酿酒性能，选育出优质非酿酒酵母菌，为生产酿造出具有地域特色的葡萄酒提供理论参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

葡萄样品：新疆赤霞珠葡萄。

非酿酒酵母菌株Y2（Galactomycessp.）、Y3（Rhodotorulasp.）、Y5（Candidasp.）、Y10（Hanseniasporasp.）、Y13（Meyerozymasp.）、Y16（Pichiasp.）、Y19（待进一步鉴定）均由本实验室保藏，经26S rRNA测序，系统进化树见图1。

工业菌株：D-254、L-2323 购自澳大利亚玛丽酵母有限公司。

试验所用试剂及药品均为试剂纯、分析纯，购自新疆沃德生物公司。

1.2 仪器与设备

GC-MS3100型气相色谱质谱计算机联用仪：北京东西分析仪器有限公司；R-200增强型旋转蒸发仪：瑞士BUCHI公司；BILON-650Y型超声波萃取仪：上海比朗精密仪器有限公司；85-2型恒温磁力搅拌器：上海乔枫实业有限公司；pHS-3b型精密pH计：日本岛津公司。

1.3 试验方法

1.3.1 葡萄汁预处理

采自新疆葡萄产区赤霞珠葡萄，经去梗破碎成汁，加热至70 ℃保持20 min，冷却至室温后重复操作连续3 d，以消除自然微生物的影响[6]。

1.3.2 混合发酵葡萄酒

以本实验室前期研究非酿酒酵母菌与工业菌株混合发酵的最佳工艺发酵葡萄酒。

1#酒样：前期添加非酿酒酵母Y2，20 ℃发酵54h后接入工业菌株D-254，25 ℃混合发酵，接入比例为1∶3，总接种量为0.08%，发酵120h结束，装瓶；2#酒样：前期添加非酿酒酵母Y3，其他条件与1#酒样相同；3#酒样：前期添加非酿酒酵母Y5，其他条件与1#酒样相同；4#酒样：前期添加非酿酒酵母Y19，其他条件与1#酒样相同；5#酒样：前期添加非酿酒酵母Y13，其他条件与1#酒样相同；6#酒样：前期添加非酿酒酵母Y16，其他条件与1#酒样相同；7#酒样：前期添加非酿酒酵母Y10，其他条件与1#酒样相同；8#酒样：工业菌株D-254，活化后25 ℃发酵，接种量为0.08%，发酵120h结束，装瓶；9#酒样：新疆某葡萄酒厂刚发酵的成品酒，发酵菌株为L-2323。

1.3.3 酒样预处理[7]

取50 mL酒样加入100 mL具塞锥形瓶中，用移液枪吸取20 μL 2-辛醇（l.000 969 g/L）酒精溶液（内标物），称取2 g MgSO4，吸取20 mL二氯甲烷，用封口膜快速完成密封隔绝空气；具塞锥形瓶放置在可控温的磁力搅拌器上的冰浴里，温度控制在0 ℃完成搅拌萃取（500 r/min）l h后混合液经超声波萃取15 min（25 ℃），收集有机相，无水硫酸钠干燥，旋转蒸发仪浓缩至2 mL，氮吹至l mL，供GC/MS上机分析。

1.3.4 色谱条件[8]

进样口温度260 ℃，柱温箱起始温度60 ℃，保留时间2.5 min，6 ℃升至240 ℃，保留15 min；载气为He，恒流1 mL/min；分流比80∶1。质谱条件：电离方式电子电离源（electron ionization，EI），电离电压70 eV，离子源温度200 ℃，连接杆温度260 ℃。

1.3.5 数据分析

数据处理[9]：独立重复进行3次试验，结果表示3次测定的平均值。试验所得数据反复进行方差分析，显著性差异通过T检验计算；

香气成分定性分析[10]：采用质谱计算机自带的NIST 2.0和Wiley谱库检索定性，各香气物质组分的质谱经计算机谱库检索，结合解析谱图，确定香气物质；

香气成分定量分析[11]：采用内标法，以2-辛醇作为内标物对葡萄酒香气成分进行定量分析，计算出香气物质的含量。计算公式[12]：

式中：设f=1，内标浓度为100%

2 结果与分析

2.1 26S rRNA测序结果

试验所用菌株的26S rRNA系统发育分析见图1。

图1 26S rRNA 基因序列的酵母菌株系统发育分析Fig.1 26S rRNA gene sequence phylogenetic analysis of yeast strains

2.2 GC-MS检测结果

1#～9#葡萄酒样香气成分GC-MS总离子图见图2～图10。

图2 1#葡萄酒样香气成分GC-MS总离子图Fig.2 GC-MS total ion chromatogram of 1#wine aroma components

图3 2#葡萄酒样香气成分GC-MS总离子图Fig.3 GC-MS total ion chromatogram of 2#wine aroma components

图4 3#葡萄酒样香气成分GC-MS总离子图Fig.4 GC-MS total ion chromatogram of 3#wine aroma components

图5 4#葡萄酒样香气成分GC-MS总离子图Fig.5 GC-MS total ion chromatogram of 4#wine aroma components

图6 5#葡萄酒样香气成分GC-MS总离子图Fig.6 GC-MS total ion chromatogram of 5#wine aroma components

图7 6#葡萄酒样香气成分GC-MS总离子图Fig.7 GC-MS total ion chromatogram of 6#wine aroma components

图8 7#葡萄酒样香气成分GC-MS总离子图Fig.8 GC-MS total ion chromatogram of 7#wine aroma components

图9 8#葡萄酒样香气成分GC-MS总离子图Fig.9 GC-MS total ion chromatogram of 8#wine aroma components

图10 9#葡萄酒样香气成分GC-MS总离子图Fig.10 GC-MS total ion chromatogram of 9#wine aroma components

2.3 NIST谱库检索分析

对检测到的化合物通过NIST谱库进行检索，选取匹配度大于800以上的所有化合物，9种酒样中共检测到16种物质，其中酯类物质7种，醇类6种，其他香气物质3种（见表1）。

由表1可知，检测到赤霞珠葡萄酒的主要香气成分为3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、2-甲基-丙醇、1-己醇、辛酸乙酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、琥珀酸二乙酯、3-羟基丁酸乙酯、癸酸乙酯、乙酸己酯。

以Y10（Hanseniasporasp.）孢汉逊酵母属发酵的7#赤霞珠葡萄酒的主要优势特征香气较其他组分略高，尤其是己酸乙酯高于工业菌株D-254发酵8#葡萄酒；乙酸己酯、糠醛高于成品酒9#。说明非酿酒酵母菌与工业菌株混合发酵方法可行，可以在一定程度上提高葡萄酒的香气成分。

2.4 主要香气成分分析

（1）醇类：主要来源于发酵、氨基酸的转化及亚麻酸降解物的氧化[13]，本次试验检测到醇类物质6种，试验中所有酒样的3-甲基-1-丁醇、苯乙醇相对含量较高，苯乙醇具愉快的玫瑰花香、蔷薇香气、茉莉香、丁香、花粉味；2-甲基-1-丙醇相对含量也较高，具青草、植物香气。说明在酒精发酵过程中，酵母发酵使醇类化合物大量生成，最终构成了葡萄酒的香气成分。

（2）酯类与内酯类：葡萄酒中的酯类主要来源于3种途径[14]：存在于葡萄浆果果皮中的构成果香的酯类；在发酵过程中由酵母菌和细菌活动形成的酯类；在贮藏过程中由酯化反应形成的酯类。本次试验共检测到酯类物质7种，辛酸乙酯含量最高，具青苹果味、果香、草莓香、茴香味，有益于葡萄酒的香气质量；己酸乙酯具有果香、青苹果味、香蕉味、白兰地味；癸酸乙酯具有白兰地味、果香、葡萄香。其构成了葡萄酒的主要香气特征。

（3）在酒精发酵中生成的有机挥发酸，主要是乙酸、戊酸和异戊酸以及每升几百毫克的己酸、辛酸及葵酸等。其他酮类、酚类和醚类化合物在9种酒样中均未检测到。

3 结论

以不同非酿酒酵母菌株与工业菌株混合发酵赤霞珠葡萄酒，GC-MS分析其香气成分，结果表明，非酿酒酵母菌株与酿酒酵母菌株混合发酵，可以把浆果中的中性化合物转化为芳香化合物[6]，增加酒的香气成分，进而增加酒的感官特性。

葡萄酒香气是葡萄酒品质评价的重要标准之一[13]，近年来，葡萄酒香气成分的研究呈上升趋势，到目前为止，已经被鉴定存在于葡萄酒中具有挥发能力的化学物质大约在1 000种以上[13]，可划分为醇类物质、酯类物质、酸类物质等九大类，这些香气物质在同一葡萄酒环境中通过相互作用构成了每种葡萄酒独有的香气类型。而在本次试验中，香气成分检测较少，试分析原因如下：

（1）葡萄酒是十分复杂的酒精饮料[14]，香气成分种类繁多，一些成分含量极低，很难被检测到，另一些成分极其不稳定，在分离提取时容易发生结构变化。因此，分析葡萄酒香气成分是一项复杂的研究工作。由于香气成分极低的物质必须在高度富集的条件下才能被检测到；另外在葡萄酒的香气分离提取过程中会人为添加一些非原葡萄酒具有的香气或者一些其他有机杂质，这部分香气或有机物质可能会在GC-MS分析图谱图中覆盖或者影响葡萄酒中原有的一些香气成分；

（2）本试验样品为发酵刚刚结束酒样，此时酒体粗糙、酸涩，饮用质量较差，通常称之为生葡萄酒[15]，此时香气成分较少，不易检测。必须经过一系列的物理、化学变化后，才能达到最佳饮用质量；本次试验在对照试验设计中，应以陈酿成品酒作对照，李记明等[16]研究发现，葡萄挥发性香气物质不仅有明显的品种差异，而且有典型的年份特征；

（3）香气成分预处理，本试验所用方法为液液萃取，因为有机溶剂具有同时萃取葡萄酒中的高、中、低浓度香气物质的能力[17]。但是萃取液经过蒸馏和浓缩，也许会导致一部分香气物质的降解或形成一些新的物质，从而影响葡萄酒香气分析的准确性。

后期研究的重点是分析不同陈酿时间、不同样品处理方式对葡萄酒香气成分的影响，研究其具体的特征香气以及形成机理。

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