枸杞酒枸杞酶解条件的研究

汤卫华，曹天一，王立晖，殷海松，乔长晟*

（1.天津现代职业技术学院 生物化工系，天津 300350；2.天津市工业微生物重点实验室，天津 300457）

以枸杞（Lycium barbarum）为原料酿造的果酒具有酒精度低、酒质温和爽口、果香味浓和营养价值高等特点，基本保持了枸杞的天然营养成分，富含枸杞多糖、枸杞黄酮、维生素、矿物质等多种抗氧化物质，具有抗老化、抗疲劳、抗肿瘤等作用，是具有很大开发潜力的酒种[1-4]。

枸杞中含有约40%～55%（以干质量计）的总糖（还原糖占22%～28%，葡聚糖占13%）、纤维素占10%，果胶占2%[5]。尽管枸杞中含有较多的糖，但有很大一部分是以葡聚糖、果胶、纤维素的形式存在，而这些是糖酵母是不能利用的。

本实验通过添加外源酶（葡聚糖酶、果胶酶和纤维素酶）分解枸杞中的难以被酵母利用的多糖，一方面可以提高枸杞原料的利用率；另一方面枸杞细胞壁的主要成分为纤维素和葡聚糖，可以增加枸杞细胞壁的通透性，使枸杞中很多香味物质及活性物质更好地溶解到酒中，提高枸杞酒的风味。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

宁夏中宁枸杞：市购；酵母菌：天津科技大学工业微生物重点实验室保藏。

果胶酶（5 000 U/g）、纤维素酶（10 000 U/g）和葡聚糖酶（5 000 U/g）：天津市诺奥科技发展有限公司；蔗糖、3，5-二硝基水杨酸（分析纯）：天津市化学试剂一厂。

1.2 仪器与设备

SS230-A打浆机：广东医疗器械厂；FA2004电子天平：上海精科天平仪器厂；7890A气质联用仪：美国安捷伦公司；HH-2数显恒温水浴锅：国华电器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 枸杞浆液的制备

将枸杞洗净，将枸杞与水按固液比为15∶85置于打浆机中打浆10 min，制备成15%的枸杞浆，备用。

1.3.2 枸杞酒加工工艺流程[6]

操作要点：

分选：选用规格为220～280 粒/50 g的鲜红色干枸杞。

配比：将枸杞与水配成质量分数15%的枸杞浆，备用。

成分调整：根据发酵时生成酒精度要求调整糖度。根据1.7 g/100 mL糖生成1°酒精来补加糖量。

活性干酵母活化：在3%的蔗糖溶液中，加入3%（g∶mL）活性干酵母，40 ℃条件下活化40～45 min，然后直接添加到醪液中去。

酒精发酵：将调整好的果浆接入活化好的活性干酵母，在一定温度下发酵。

澄清过滤：原酒陈酿后基本澄清，但酒中仍有稳定的胶体、蛋白质等成分，易形成浑浊和沉淀。为提高酒的稳定性，仍需加澄清剂处理，经过滤然后装瓶即得成品。

1.3.3 复合酶制剂作用温度和时间的确定

复合酶制剂在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃条件下作用一段时间后测定还原糖的含量；复合酶制剂在常温条件下处理0、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h后，测定还原糖含量。

1.3.4 果胶酶添加量对枸杞浆液中还原糖含量的影响

取5份15%的枸杞浆100 mL，分别加入枸杞干质量0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的果胶酶，50 ℃加热4 h后测定还原糖含量。

1.3.5 纤维素酶添加量对枸杞浆液中还原糖含量的影响

取5份15%的枸杞浆100mL，分别加入枸杞干质量0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的纤维素酶，50 ℃加热4 h后测定还原糖含量。

1.3.6 葡聚糖酶添加量对枸杞浆液中还原糖含量的影响

取5份15%的枸杞浆100 mL，分别加入枸杞干质量0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的葡聚糖酶，50 ℃加热4 h后测定还原糖含量。

1.3.7 复合酶制剂对枸杞浆的影响

选取果胶酶、纤维素酶、葡聚糖酶3个因素，根据单因素试验结果，进行3因素3水平正交试验，将复合酶制剂添加至15%的枸杞浆中，作用温度为30 ℃，作用时间为4 h，测定其还原糖含量，所得结果用SAS软件进行分析。

1.3.8 气质联用分析条件

枸杞酒的主要挥发成分用气质联用进行测定，并将这些物质的香味进行归类[7-8]。

气相色谱条件：进样方式：固相微萃取；HP-INNOWAX（30m×250 mm×0.25 μm）色谱柱；进样口温度250 ℃；程序升温：初始温度50 ℃，保留2 min；240 ℃保持15 min；载气：高纯氦气；氦气流速1 mL/min；进样量1 μL；分流比10∶1；气相定量用乙酸异戊酯作为内标物。

表1 酶解条件优化正交试验因素与水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for enzymolysis conditions optimization

质谱条件：离子源温度200 ℃，电离电压70 eV，扫描方式为全扫描，扫描范围30～350m/z。

1.3.9 其他检测方法[9]

还原糖：3，5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）法；可溶性固形物：手持糖度计法；果胶：重量法。

2 结果与分析

2.1 果胶酶对枸杞浆中还原糖含量的影响

取5份15%的枸杞浆100mL，分别加入枸杞干质量0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的果胶酶[10]，50 ℃加热4 h后测定还原糖含量，结果见图1。

图1 果胶酶添加量对枸杞浆液中果胶含量的影响Fig.1 Effect of pectinase dosage on pectin content in wolfberry juice

由图1可知，随着果胶酶添加量增加，还原糖含量也在增加，但果胶酶添加量为0.3%、0.4%、0.5%时差异不明显。因此选定果胶酶0.2%为最适添加量。

2.2 纤维素酶对枸杞浆中还原糖含量的影响

取5份15%的枸杞浆100 mL，分别加入枸杞干质量0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的纤维素酶，50 ℃加热4 h后测定还原糖含量，结果见图2。

由图2可知，随着纤维素酶添加量增加，枸杞浆中的还原糖含量也在增加，但当添加量＞0.3%后，枸杞浆中的还原糖含量只有微量的增加，因此选定纤维素酶0.3%为最适添加量。

2.3 葡聚糖酶对枸杞浆中还原糖含量的影响

取5份15%的枸杞浆100 mL，分别加入枸杞干质量0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%的葡聚糖酶，50 ℃加热4 h后测定还原糖含量，结果见图3。

图2 纤维素酶添加量对枸杞浆液中还原糖含量的影响Fig.2 Effect of cellulose addition on reducing sugar content of wolfberry juice

图3 葡聚糖酶添加量对枸杞浆液中还原糖含量的影响Fig.3 Effect of dextranase dosage on reducing sugar content of wolfberry juice

由图3可知，随着葡聚糖酶添加量增加，枸杞浆中的还原糖含量也在增加，但当添加量＞0.2%时，枸杞浆中的还原糖含量只有微量的增加，因此选定葡聚糖酶添加量0.2%为最适添加量。

2.4 复合酶制剂的作用温度和时间对枸杞中还原糖含量的影响

取复合酶制剂（果胶酶/纤维素酶/葡聚糖酶=1∶1∶1）以0.2%的添加量加入至15%枸杞浆中[11-13]，在20 ℃、30 ℃、40 ℃、50 ℃作用4 h后测定果胶和还原糖的含量；另一份复合酶制剂同样以0.2%的添加量加入15%枸杞浆中，在30 ℃处理0 h、1 h、2 h、3 h、4 h、5 h、6 h后，测定还原糖含量，结果如图4（a）和4（b）所示。

图4（a）显示，温度为20 ℃时，还原糖的含量为49.5 g/L，继续增加至30 ℃，还原糖的含量增至54.5 g/L；继续提高温度，还原糖的含量增加不明显，因此选择水解温度为30 ℃。

图4（b）表明，随着水解时间的提高，还原糖含量也增加，水解4 h后还原糖含量达到最大值56.9 g/L，因此选择复合酶制剂水解时间为4 h。

图4 复合酶制剂水解温度(a)和水解时间(b)对枸杞浆液中果胶含量的影响Fig.4 Effect of hydrolysis temperature (a) and hydrolysis time (b)on pectin content of wolfberry juice

2.5 果胶酶、纤维素酶、葡聚糖酶复合处理对枸杞浆的影响

复合酶制剂加入到15%的枸杞浆中，水解温度为30 ℃，水解时间为4 h，以还原糖含量为考察指标，按照1.3.9进行正交试验，结果及极差分析见表2，方差分析结果见表3。

表2 酶解条件优化正交试验结果与分析Table 2 Result and analysis of orthogonal experiments for enzymolysis conditions optimization

由表2可知果胶酶（A）、纤维素酶（B）及葡聚糖酶（C）对糖化结果影响顺序为C＞B＞A，组合A2B3C2最好，即果胶酶0.2%、纤维素酶0.4%和葡聚糖酶0.2%。在此最佳条件下进行验证试验，还原糖含量为85.63 g/L。由表3可知，葡聚糖酶含量对结果影响显著，果胶酶及纤维素酶对结果无显著影响。

表3 正交试验结果方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal experiment results

2.6 枸杞酒的香气分析

成熟枸杞果实中的主要香气成分为藏红花醛、β-紫罗兰酮、2-羟基-β-紫罗兰酮和马铃薯螺二烯4种物质[14-15]。因此，在气质联用检测中，枸杞酒样中以上4种物质的总含量越高则果香越浓郁，酶解前和酶解后枸杞酒中香气成分气质联用色谱图见图5，含量测定结果见表4。

图5 酶解前(a)后(b)枸杞酒香气成分气质联用色谱图Fig.5 GC chromatogram of aroma component of wolfberry juice before (a) and after (b) enzymatic process

表4 酶解前后枸杞浆主要香气成分分析Table 4 Main aromatic components of wolfberry juice before and after enzymatic process

由表4可知，酶解后主要香气成分的含量都高于酶解前，酶解后香气总和为13.46 mg/L，是酶解前的1.04倍，表明复合酶的处理除了能够提高枸杞汁中的还原糖的含量外，同时有利于枸杞中香味物质的释放，提高枸杞酒的果香味。

3 结论

正交试验确定复合酶制剂影响顺序为葡聚糖酶＞纤维素酶＞果胶酶，复合酶制剂的最佳组合是葡聚糖酶、纤维素酶和果胶酶添加量分别为0.2%、0.3%和0.2%，在最适温度30 ℃水解含15%枸杞的枸杞浆4 h，还原糖的含量达到85.63 g/L，是对照组的3.53倍。同时复合酶制剂能促进枸杞中香味物质的释放，酶解前的主要香味物质总和是12.91 mg/L，酶解后主要香味物质总和达到13.46 mg/L，增加1.04倍，使发酵后的成品酒枸杞的香味更浓郁。

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