酵母抽提物鲜味（umami）及浓厚味（kokumi）滋味活性的评价与研究

刘建彬，宋焕禄

（北京工商大学 分子感官科学实验室，北京 100048）

作为天然食品，酵母抽提物（yeast extract，YE）广泛应用于食品的调香及调味[1]。YE是采用面包酵母、啤酒酵母等原料经发酵、自溶、水解、浓缩等工艺制成的膏状或粉状产品[2]。YE富含氨基酸、核苷酸、多肽及B族维生素，这些化合物同时也是其典型风味的物质基础[3]。在现代食品工业中，YE具有两大作用：一方面，作为风味原料或气味前驱物，应用于食品气味的增强尤其是肉味的增强中[4]；另一方面，其还常作为滋味促进剂而被应用于食品的提鲜中[5]。YE是一种极佳的风味增强食品，具有很好的应用前景。

鲜味（umami）是最近被人们认可的一种基本味，其经常被形容为谷氨酸及其盐类的味道。自从1908年被发现以来，多种化合物如谷氨酸及其钠盐、天门冬氨酸及其钠盐、5’-核苷酸及其钠盐、琥珀酸及其钠盐等被鉴定出具有鲜味[6]。浓厚味（kokumi）这一概念是由日本科学家提出来的，被形容为满口感和味觉复杂感[7]。作为一种滋味增强剂，有浓厚味效果的物质本身通常没有味道或者没有其所表现的味道。近些年的研究发现，多种小肽具有重要的浓厚味效果[8-10]。谷胱甘肽是第一种被明确鉴定出具有浓厚滋味效果的物质[11]。在鲜味呈现机制的研究中，L-谷氨酸选择G蛋白，代谢型谷氨酸受体4亚型（metabotropic glutamate receptor 4，mGluR4）和代谢型谷氨酸受体1亚型（metabotropic glutamate receptor 1，mGluR1），味蕾表达异质二聚体T1R1+T1R3等受体对鲜味具有关键作用，进一步的研究发现，在有核苷酸、多肽等多种物质存在时，多个味觉受体表现出复杂的协同关系[12]。而味蕾上的钙离子受体（calcium-sensing receptor，CaSR）被明确报道为kokumi物质的味觉受体，可以起到对咸味、甜味、鲜味多个滋味的提升作用[13]。

目前关于YE风味的研究中，多集中在对其气味活性化合物的探索[4，14-16]。滋味方面，FESTRING D等[5]从酵母抽提物模型美拉德反应体系中鉴定出鲜味提升N2-（1-羧乙基）-鸟苷-5’-单磷酸盐。而其他尚无关于YE滋味活性的尤其是umami及kokumi的报道。

本研究采用切向流超滤（ultra-filtration，UF）、凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography，GPC），高效液相色谱（high performance liquid chromatography，HPLC）等分离技术，对YE中的umami及kokumi活性组分如肽段、5’-核苷酸及谷胱甘肽进行分离、定性及定量。应用模型溶液构建、描述性感官鉴评、时间-反馈鉴评、剂量-反馈鉴评技术对YE的umami和kokumi活性进行描述和评价。为YE在滋味促进方面的应用提供支持和指导。

1 材料与方法

1.1 材料

普通酵母抽提物（normal yeast extract，NYE）、高纯酵母抽提物（high pure yeast extract，HPYE）、高肌苷酸（Inosine monophosphate，IMP）+鸟苷酸（guanosine monophosphate，GMP）酵母抽提物（HIGYE）：湖北安琪酵母有限公司；实验室用高纯水：Millipore Simplicity 系统自制；KH2PO4、Tris-HCl缓冲液、磷酸缓冲液、甲醛、5，5’-二硫代二硝基苯甲酸（5，5’-dithiobisnitrobenzoicacid，DTNB）染液、蔗糖、乳酸、咖啡因、NaCl、谷氨酸钠、肌苷酸、鸟苷酸：国药集团试剂公司；鸡肉粉：春发生物科技公司；5’-腺苷酸（5’-adenosine monophosphate，5’-AMP）、5’-肌酸酸钠（5’-inosine monophosphate，5’-IMP）、5’-胞苷酸（5’-cytidine monophosphate，5’-CMP）、5’-GMP、VB12、还原型谷胱甘肽（glutathione，GSH）、甘氨酸（glycine，Gly）、抑肽酶标准品：美国Sigma公司；其他色谱纯试剂均购自美国Fisher公司。

1.2 仪器与设备

1200 Series高效液相色谱系统：美国安捷伦公司；Mini Pellicon切向流超滤系统：德国默克密理博公司；ÄKTA蛋白纯化仪：美国GE公司；ALPHA1-4 LSC冷冻干燥机：德国Christ公司；UV-2550紫外分光光度计：日本岛津公司。

1.3 方法

1.3.1 滋味水溶提取物的制备

取20g酵母粉状酵母抽提物溶于200mL高纯水中，室温充分搅拌溶解，超声均质10min，抽滤后进行下步分离。

1.3.2 不同分子量滋味馏分的超滤分离

滋味水溶性提取物采用切向流超滤系统进行分离。溶液依次通过5 000u、1 000u分子截留量超滤膜包多次分级分离。分别合并多级截留液和透出液，冷冻干燥。制得酵母抽提物＞5 000u、＜5 000u、1 000u～5 000u和＜1 000u粗分子质量组分。称质量，置于-20℃备用。

1.3.3 滋味活性肽的凝胶色谱层析分离

YE原始样品、＜5 000u组分在ÄKTA蛋白纯化系统中进一步进行凝胶色谱层析分离。系统配有P-900泵，UV-900三波长检测器，pH/900 pH检测器及Frac-920自动收集器。1g样品溶于1mL高纯水中，各组分经一根GE Superdex peptide 10/300 GL色谱柱进行分离，上样量100μL，流动相为纯水，用1%甲酸调整pH值为0，流速0.5mL/min。测定波长220nm及280nm条件下的吸光度值，样品被分为7个馏分（I-VII），分别收集合并，经冷冻干燥置于-20℃备用。

为了确定酵母抽提物中的多肽分布，同样条件下用抑肽酶（6512u）、VB12（1343.3u）、还原型GSH（307.3u）、Gly（75u）制作分子质量标准曲线。

1.3.4 谷胱甘肽含量的测定

谷胱甘肽是酵母抽提物中明确含有的kokumi物质。谷胱甘肽的含量采用5，5’-二硫代双（2-硝基苯甲酸）（DTNB）法按照赵旭东等[17]的测定方法进行测定，母液浓度为0.01g/mL。

1.3.5 5’-核苷酸含量的测定

5’-核苷酸钠盐是重要的umami物质，酵母抽提物中5’-核苷酸钠盐含量的测定采用CHO I等[18]的方法经一些改进进行。0.5g样品溶于25mL水中，煮沸1min，冷却，过0.45μm滤膜备用。样品进HPLC系统进行分析。系统配备G1322A真空在线脱气系统，G1311A四级泵，G1329A自动进样器及G1316A柱温箱。色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18色谱柱，柱温控制为20℃，流动相为50mmol KH2PO4，用磷酸调整pH值为4.3，流速为1mL/min。采用各5’-核苷酸标准品做标准曲线进行定量。

1.3.6 感官鉴评

（1）感官训练

感官鉴评小组包含有7名成员（3男4女）。为了使成员熟悉感官鉴评指标，进行了为期两个月的感官鉴评训练，每天训练的时间大于1h。用50mmol/L的蔗糖来训练甜味；用20mmol/L的乳酸来训练酸味；用20mmol/L的NaCl来训练咸味；用1mmol/L的咖啡因来训练苦味；3mmol/L的谷氨酸钠（monosodium glutamate，MSG）来训练鲜味；配制含有10mmol/L谷氨酸钠和20mmol/L NaCl的鲜味模型溶液，添加5mmol/L的谷胱甘肽来训练kokumi滋味的鲜味提升作用；配制含有10mmol/L NaCl和鸡肉粉的空白鸡汤溶液，添加5mmol/L的谷胱甘肽来训练kokumi滋味的复杂口感作用。小组商定采用采用含10mmol/L的谷氨酸钠溶液的滋味作为基本鲜味标度。小组成员之间互相交流商议确定描述性语言。所有的训练分3个部分进行，每个部分间隔5min用清水漱口，整个训练和评价在25～30℃进行。

（2）描述性鉴评实验

进行描述性鉴评式样对酵母抽提物及其个分离馏分的umami及kokumi滋味活性进行定性描述。相同质量浓度的各酵母抽提物原液、酵母抽提物超滤分离馏分、凝胶层析分离馏分均送感官鉴评小组进行描述性鉴评。对于鲜度和鲜味提升的鉴评，采用评分法，从0～10表示鲜味从没有检出到非常强烈。原液描述鉴评实验采用3种模型溶液：MSG（15mmol/L）-NaCl（20mmol/L）模型溶液、（I+G）（0.5g/L）+NaCl（20mmol/L）模型溶液、空白鸡汤-NaCl（10mmol/L）模型溶液。各馏分鉴评只采用标准MSG（15mmol/L）-NaCl（20mmol/L）模型溶液。

（3）感官反馈实验

为了确定酵母抽提物对鲜味剂的作用，对不同质量浓度高纯酵母抽提物进行了感官反馈实验（sensory-response experiment，SRP）[19]。对于剂量-反馈实验（dose-responseexperiment，DRE），一系列质量浓度0、0.05g/L、0.25g/L、0.50g/L、2.50g/L、5.00g/L、25.00g/L的酵母抽提物样品分别添加至MSG（15mmol/L）-NaCl（20mmol/L）模型溶液和（I+G）（0.5g/L）+NaCl（20mmol/L）模型溶液中。感官鉴评小组对各溶液的鲜味强度进行评分。对于时间-反馈实验（Time-response experiment），取0.5g/L高纯酵母抽提物于（I+G）（0.5g/L）+NaCl（20mmol/L）模型溶液，0.3g/L高纯酵母抽提物于MSG（15mmol/L）-NaCl（20mmol/L）模型溶液中进行鉴评。从入口（sip）开始计算，要求鉴评人不断咂口，每1s对鲜度进行评分，5s时吐出（spit），并持续咂口对余味进行评分，持续至10s结束。所有鉴评分3组取平均值，同组同人评分差异不得超过2个标度。作折线图来表示滋味反馈轮廓。

为了保证鉴评人员安全且高效率鉴评，所有鉴评采用啜食技术[8]。溶液在口中旋转鉴评而不咽下每个样品和样品鉴评之间都使用清水进行漱口。

1.3.7 数据统计和分析

凝胶色谱数据采用UNICORN manager分析软件进行分析；HPLC定量数据采用Agilent化学工作站B.02.01进行分析；其他差异性分析均采用SPSS 19.0进行分析。

2 结果与讨论

2.1 酵母抽提物umami及kokumi滋味活性的评价

2.1.1 描述性鉴评

3种样品描述鉴评结果见表1，高纯酵母抽提物样品HPYE具有刺舌的苦味和轻微的鲜味，并没有体现浓厚和复杂的鲜味；高I+G样品HIGYE具有典型的浓厚、持续的鲜感；普通样品具有中等苦味和中等的鲜感，有一定的浓厚感。这个结果说明了酵母抽提物中的kokumi活性物质与I+G具有増鲜、提升浓厚感、持续口感的作用。

对比酵母抽提物添加前后模型溶液的滋味特性（表1）。添加前模型溶液的鲜味具有寡淡感，单调且消失迅速，MSG-NaCl模型溶液还具有不愉快的金属后味。而添加后的溶液的鲜味被感官鉴评小组描述为具有一种饱满、持久的感觉。这种差异将其与典型鲜味模型区分开来。对空白鸡汤的实验表明，酵母抽提物对汤汁具有增加滋味复杂度，浓厚度的作用，同时，还有一定掩腥的效果。另外，酵母抽提物对I+G较MSG有更强的kokumi作用。

表1 酵母抽提物(YE)及鲜味模型溶液的描述性感官评价Table 1 Descriptive sensory evaluation of YE and umami-model solution

2.1.2 感官反馈实验

图1 添加酵母抽提物的鲜味模型溶液的剂量-反馈轮廓图Fig1 Dose-response diagram of umami-model solution with YE

剂量-感官反馈实验形象地反映了酵母抽提物对鲜味模型的释放、消失的作用。由图1可知，随着YE用量的增加，两种模型溶液的鲜味强度逐步增强。对于MSG-NaCl模型溶液，YE质量浓度达到0.25g/L时才体现出快速的増鲜效果，到2.5g/L时达到最大増鲜效果，感官鉴评也发现，在这一YE用量时，溶液开始呈现一定的苦味。对于I+G+NaCl模型溶液，YE对其鲜味提升更为明显，增鲜阈值较低（约0.05g/L），而到5g/L用量时达到最大鲜度，也开始呈现出一定的苦味。

时间-反馈实验揭示了不同样品鲜味在口中变化，即一种样品的味觉时间轮廓图。由图2可知，随着样品的啜食，未添加YE的样品的鲜度迅速达到最高值，继而迅速消失；而添加有YE的样品鲜味释放时间长且消失时间也较长，具有持久的鲜感。整体来看，YE对I+G及MSG都有明显的増鲜作用。由图2可知，在溶液刚吐出时，4种溶液的鲜度都有一个回升的过程，这对鲜味的后味呈现有很大影响。

图2 添加酵母抽提物的鲜味模型溶液的时间-反馈轮廓图Fig.2 Time-response diagram of umami-model solution with YE

表2 酵母抽提物鲜味和浓厚味相关化合物定量数据Table 2 Quantitative data for compounds related to the umami and kokumi of YE

2.2 超滤滋味馏分的筛选与鉴定

应用切向流超滤系统，将YE中的水溶性滋味化合物分为＜1 000u，1 000～5 000u，＞5 000u三个部分，各部分的含量见表2。由表2可知，高纯YE和高I+G YE的＜1 000u组分较普通YE高，且后者更高。这可能是由于较高含量的I+G导致的结果。普通YE有较高的＞5 000u的组分。这组结果说明在YE中大部分为＜1 000u的组分（纯YE含量达90.2%）。

对等量3组馏分单独及加入模型溶液进行感官鉴评，结果见表3。由表3可知，在YE中呈现kokumi效果的组分集中在＜1 000u分子质量，而1 000～5 000u组分也有轻微的kokumi效果，而＞5 000u组分完全没有效果。单独品尝发现，这些呈强烈kokumi效果的物质本身呈苦味，且具有强烈、爽快的刺舌滋味。确定以＜1 000u组分目标物，进行下一步凝胶色谱层析分离。

表3 酵母抽提物超滤组分的滋味及浓厚味效果评价Table 3 Sensory evaluation of kokumi taste of ultrafiltration components of YE

2.3 凝胶色谱分离滋味馏分的筛选与鉴定

经凝胶色谱层析分离，共分离出7个馏分（图3）。收集并冷冻干燥后，对各个组分原样和添加至模型溶液滋味进行鉴评，结果见表4。由表4可知，其中GPC-II和GPC-III，本身具有苦味，微鲜和强烈尖刺滋味，添加至模型溶液中具有强烈kokumi 和増鲜效果。经分子质量标准曲线计算，2种馏分分子质量处于200～1 000u之间。初步判断为含有2～8个氨基酸的小肽。

图3 高纯酵母抽提物中＜5 000u组分的凝胶过滤层析色谱图Fig.3 GPC chromatogram of the ＜5 000 u fraction of high pure yeast extract

2.4 酵母抽提物肽的分子量分布

对3种YE的全组分进行凝胶色谱层析分离测定其肽段分布，结果见表2。从表2结果可以看出，＜1 000u肽段仍是YE中的主要组成成分（约70%）。对比3种YE发现，高I+G YE及普通YE的＜1 000u组分含量偏高，这是由于其中高含量I+G干扰作用所致，同时对高I+G YE馏分II和III收集鉴评发现，其本身就呈现强烈的酸鲜和kokumi滋味。

表4 酵母抽提物中凝胶过滤层析馏分单独及在模型溶液中的感官评价Table 4 Sensory evaluation of single GPC fractions in water and in a model solution

2.5 谷胱甘肽含量

对3种YE的谷胱甘肽含量进行测定，标定参数见表5，测定结果见表2。表2结果显示，高纯YE中谷胱甘肽含量最高（6.828mg/g），普通YE次之，高I+G YE最低。这说明纯品YE是谷胱甘肽的主要来源。谷胱甘肽也是比较明确的具有典型kokumi效果的肽类化合物。

表5 酵母抽提物中相关滋味化合物定量标定参数Table 5 Calibration data used for quantification of taste-active compounds of YE

2.6 5’-核苷酸含量

5’-核苷酸是YE中赋予鲜味的主要物质基础。对4种核苷酸5’-AMP、5’-IMP、5’-CMP、5’-GMP的含量进行了测定，标定参数见表5，测定结果见表2。高I+G样品具有高含量的5’-IMP和5’-GMP，同时其5’-CMP含量也很高，但是并未在此样品中发现5’-AMP，可能是生产过程中定向发酵转化的结果。剩余的2个样品中，4种核苷酸均有发现。且普通YE较高纯YE各含量都高。可以得出结论，纯品YE中的核苷酸含量尤其是呈味核苷酸的含量极低（约3.530mg/g），以至于并未与其中所含的kokumi成分协同发挥效果，仅有轻微鲜味。可以通过定向发酵及人工复配的方式提高I+G含量，生产出高协同、高鲜的YE产品。

3 结论

对3种YE（高纯YE、高I+G YE、普通YE）的umami及kokumi滋味进行了评价和描述。通过超滤、凝胶层析对YE滋味组分进行了分离，初步得出分子质量处于200u～1000u的肽类，本身具有苦味及强烈刺舌滋味，对MSG-NaCl、I+G+NaCl、鸡汤-NaCl模型溶液具有増鲜，增加复杂口感及持续的满口感的kokumi效果。对3种YE的粗分子质量分布、肽分布、核苷酸含量、GSH含量进行了测定。结果得出，YE中＜1000u分子质量肽含量很高（约70%），为其主要滋味基础。通过对MSG-NaCl、I+G+NaCl模型溶液做反馈感官鉴评，得出YE浓度分别达到0.25g/L、0.05g/L时开始体现出増鲜效果，而在2种模型溶液中分别达到到2.5g/L，5g/L浓度时达到最大増鲜效果，超过这一浓度时，溶液开始呈现一定的苦味。此外，对于I+G+NaCl模型溶液，YE对其鲜味提升更为明显，增鲜阈值较低。

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