山西老陈醋中乙偶姻和川芎嗪的高效液相色谱法测定

杨宇霞，杨林娥，张 磊，韩建欣，彭晓光*

（山西省生物研究所，山西 太原 030006）

山西老陈醋是中国的四大名醋之一[1]，其不仅是人们生活必需的调味品，而且是一种保健养生食品，具有调节血糖血脂、降低血压、抗癌等功效[2]。近年来，老陈醋的药用保健作用越来越受到重视，其功能性成分也成为现代研究的热点。川芎嗪学名四甲基吡嗪（tetramethylpyrazine，TMP），是山西老陈醋的重要风味物质，也是山西老陈醋重要的功能成分之一，具有扩张血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成、改善脑缺血等多种作用[3]。乙偶姻（acetoin，ACT）学名3-羟基丁酮，是一种令人愉快的香味物质，为食品行业常用的香料品种，也是食醋中重要的风味物质。文献报道，川芎嗪形成机制的一种假设是乙偶姻和氨气反应形成的产物[4]。因此，准确测定山西老陈醋中乙偶姻和川芎嗪的含量对山西老陈醋保健功能的开发及川芎嗪生成机理的探索具有重要意义。

乙偶姻的检测方法多用气相色谱法或者气相色谱质谱联用法[5-13]，其准确性较差、相对标准偏差较大，而液相色谱法报道较少[14]。余书奇等[15]建立了一种2，4-二硝基苯肼衍生-高效液相色谱测定葡萄酒中总乙偶姻的方法，但需要进行衍生化实验，步骤繁琐。张少飞等[16]建立了高效液相色谱法单独测定山西老陈醋中的川芎嗪的方法。而乙偶姻和川芎嗪同时检测的方法鲜有报道，只有陈继承等[3]进行了一些研究。本实验建立了山西老陈醋中乙偶姻和川芎嗪的液相色谱测定方法，并针对实验条件进行了优化，期望对山西老陈醋中乙偶姻和川芎嗪的进一步研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

样品：东湖、水塔、紫林、宁化府4个品牌的市售产品和相关企业提供的山西老陈醋；乙偶姻、川芎嗪标准品：上海阿拉丁试剂有限公司；甲醇（色谱纯）：安徽时联特种溶剂股份有限公司；乙酸（分析纯）：天津市光复科技发展有限公司。

标准溶液的配制：准确称取乙偶姻2.5g、川芎嗪25mg，用流动相分别定容至50mL容量瓶中，配制成乙偶姻50mg/mL，川芎嗪500μg/mL的标准储备液。把乙偶姻、川芎嗪标准储备液分别稀释不同倍数，配制成混合标准使用液。

1.2 仪器与设备

1100高效液相色谱仪：美国Agilent公司，配有四元泵、在线脱气机、自动进样器、紫外检测器和化学工作站；KQ-500D超声波清洗仪：东莞市科桥超声波仪器有限公司；TG16-WS高速离心机：长沙湘智离心机仪器有限公司；NW150V超纯水系统：上海康雷分析仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 样品处理

取4mL样品，调pH值为7.2，用提取剂定容至25mL。超声提取45min，10 000r/min离心5min，去除沉淀，取上清液用0.22μm微孔滤膜过滤，上机测定。

1.3.2 色谱条件

色谱柱：Agilent TC-C18（2）（4.6mm×250mm，5μm）；检测器：紫外检测器；检测波长279nm；流动相：1%醋酸水溶液（加0.05%三氟乙酸）/甲醇=70∶30；流速0.8mL/min。

2 结果与分析

2.1 色谱柱的确定

分别选择Agilent TC-C18（2）、Agilent Zorbax SB-C18、Agilent Zorbax SB-Aq色谱柱进行筛选试验，结果表明，Agilent TC-C18（2）色谱柱对乙偶姻和川芎嗪的保留时间和分离效果都较好，故最终选择Agilent TC-C18（2）作为分析用色谱柱。

2.2 检测波长的确定

用190～400nm紫外光对乙偶姻、川芎嗪标准溶液进行扫描，综合考虑乙偶姻和川芎嗪的吸收强度，最终选择二者都有较强吸收的279nm作为检测波长。

2.3 提取剂的确定

分别用1%醋酸水溶液（加0.05%三氟乙酸）和5%醋酸水溶液与甲醇以20∶80的比例混合，配制成提取剂1和2进行实验，不同提取剂对乙偶姻、川芎嗪的提取峰面积结果见表1。由表1可知，提取剂1的提取效果明显优于提取剂2，故确定1%醋酸水溶液（加0.05%三氟乙酸）/甲醇=20∶80为实验用提取剂。

表1 不同提取剂对乙偶姻和川芎嗪的提取效果Table 1 Extraction effect of ACT and TMP with different extraction solvents

2.4 提取剂比例的确定

分别配制甲醇体积分数为0、30%、50%、80%、90%、100%的提取剂进行实验，结果见表2。由表2可知，随着甲醇体积分数的增加，乙偶姻、川芎嗪的峰面积增大。当甲醇体积分数达到目的80%时，二者的提取效果最佳。甲醇体积分数继续增加，二者的峰面积开始减小，故最终确定1%醋酸水溶液（加0.05%三氟乙酸）/甲醇=20∶80为实验条件。

表2 不同甲醇比例对乙偶姻和川芎嗪的提取效果的影响Table 2 Effects of methanol proportion on extraction effect of ACT and TMP

2.5 pH值的确定

取同一样品，调节不同的pH值进行实验。不同pH值下，乙偶姻、川芎嗪的提取峰面积结果如表3所示。从表3可以看出，随着pH值的升高，二者的提取峰面积增大。当pH值达到7.2时，提取效果最好。随着pH值的继续增加，乙偶姻和川芎嗪的提取峰面积开始减小，故最终选择pH值7.2为实验条件。

表3 不同pH值对乙偶姻和川芎嗪提取效果的影响Table 3 Effects of pH on extraction effect of ACT and TMP

2.6 线性范围、相关系数及检出限

将乙偶姻和川芎嗪标准储备液分别稀释不同的倍数，配制成混合标准使用液系列，进样分析。以乙偶姻和川芎嗪的峰面积（Y）对相应的质量浓度（X）进行线性回归，以3倍信噪比（S/N=3）计算检出限，结果见表4。乙偶姻、川芎嗪混合标准溶液色谱图见图1。

表4 线性方程、相关系数及检出限Table 4 Linear equation,correlation coefficient and detection limit

由表4可知，乙偶姻和川芎嗪在所测试质量浓度范围内具有良好的线性关系，相关系数均达到0.999 99，检出限分别为7.335μg/mL、0.068μg/mL，高效液相色谱法同时测定乙偶姻和川芎嗪线性范围宽，检测限低，具有较高的灵敏度。

图1 乙偶姻、川芎嗪混合标准溶液色谱图Fig.1 Chromatogram of the mixed standard solution of ACT and TMP

2.7 精密度

将同一老陈醋样品，按1.3节色谱条件连续进样6次，对乙偶姻和川芎嗪的峰面积进行测定，结果见表5。

表5 方法精密度实验结果Table 5 Results of precision experiments

由表5可知，乙偶姻和川芎嗪峰面积的相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）分别为1.67%和0.20%，表明方法精密度较好。

2.8 回收率

取同一老陈醋样品，采用样品加标的方法计算回收率，结果见表5，老陈醋加标色谱图见图2。从表6可以看出，乙偶姻、川芎嗪的加标回收率在96.5%～104.1%之间，方法准确性较高，适合于山西老陈醋中乙偶姻和川芎嗪的检测分析。

表6 方法回收率实验结果Table 6 Results of recovery rate experiments

2.9 样品的测定

按照上述方法，对几种品牌山西老陈醋样品进行测定，结果见表7。

图2 山西老陈醋加标色谱图Fig.2 Chromatogram of Shanxi aged vinegar spiked with ACT and TMP

表7 山西老陈醋样品中乙偶姻和川芎嗪的含量Table 7 Content of ACT and TMP in Shanxi aged vinegar samples

由表7可知，山西老陈醋样品中均含有不同质量浓度的乙偶姻和川芎嗪，但不同品牌山西老陈醋样品乙偶姻和川芎嗪的含量存在一定的差异，乙偶姻的质量浓度分布范围0.95～3.00mg/mL，川芎嗪的质量浓度范围在44.74～285.68μg/mL之间。可见，乙偶姻和川芎嗪是山西老陈醋中重要的风味物质，一定程度上可以反映山西老陈醋的保健功效。

3 结论

川芎嗪和乙偶姻都是山西老陈醋中重要的风味物质，采用酸性甲醇溶液提取，高效液相色谱法测定，乙偶姻、川芎嗪的回收率在96.5%～104.1%之间，相对标准偏差（RSD）≤1.67%，方法前处理简单，精密度高、准确性好，该方法可作为山西老陈醋中乙偶姻和川芎嗪含量测定的参考方法，为山西老陈醋的品质控制和保健功能的开发提供依据。

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