精卵孵育过程中活性氧对体外受精-胚胎移植结局的影响*

张 娜张 轶张耀恒赵世彬乜照燕甄秀丽李亚丽

1. 河北医科大学第四医院（石家庄 050011）;

2. 五矿邯邢矿山局职工总医院；3. 河北省人民医院

精卵孵育过程中活性氧对体外受精-胚胎移植结局的影响*

张 娜1**张 轶1张耀恒2赵世彬1乜照燕1甄秀丽1李亚丽3

1. 河北医科大学第四医院（石家庄 050011）;

2. 五矿邯邢矿山局职工总医院；3. 河北省人民医院

目的通过检测洗精培养液和受精培养液中活性氧的关系，探讨精卵孵育不同时间对体外受精-胚胎移植（IVF-ET）结局的影响。方法接受常规体外受精（IVF）受精的夫妇161例，精液经处理后留取标本（即洗精培养液）3份，分别定为加精后0h、5h和20h检测过氧化氢（H2O2）、过氧化氢酶（CTA）。每名患者取出的卵冠丘复合物（OCCCs）随机分为两组：A组为短时受精，B组为长时受精，检测移卵后的受精培养液中H2O2、CTA的含量。移植的123名患者随机分成两组，一组62人选择短时受精的胚胎进行移植，另一组61人选择长时受精的胚胎进行移植。结果H2O2及CTA水平在授精后5h明显与A组呈正相关（r值分别为0.477和0.518，P＜0.05），在授精后20h与B组呈明显正相关（r值分别为0.681和0.868，P＜0.05）。授精后5h及授精后20h的洗精培养液中H2O2水平均明显高于相应时间的受精培养液（P＜0.05），而CTA水平只在授精后5h明显低于A组的受精培养液（P＜0.05），在授精后20h与B组之间没有明显差异（P＞0.05）。B组的多精受精率明显高于A组（P＜0.05），A组的优胚率明显高于B组（P＜0.05），两组间的受精率、卵裂率、植入率、临床妊娠率无统计学差异。结论 缩短精卵孵育时间可以使卵子尽早脱离高活性氧的环境，有利于胚胎的发育。

体外受精; 胚胎移植; 活性氧

在体外受精（IVF）中精卵结合并孵育是一个复杂而重要的过程。受精情况以及胚胎质量直接关系到体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer, IVF-ET）治疗的结果。传统的操作过程是将卵子和精子共培养16～18h，称为长时受精或过夜培养。这种受精方式能保证卵子有足够的时间受精，从而获得良好的受精率。然而成熟卵的受精过程在精卵相遇的2～4h内便可完成。因此，长时受精与短时受精的利弊近年来逐渐成为生殖医学的研究热点。本研究通过分析精液处理后不同时间洗精液中以及长、短时受精受精液中活性氧的相关性，对比长时受精与短时受精两种精卵孵育时间的实验室参数及临床结局，探讨精卵孵育不同时间对体外IVF-ET结局的影响。

材料与方法

一、研究对象

2010年11月至2012年12月于我院生殖医学科接受常规IVF助孕的夫妇161例，男性既往检查精液各参数正常，排除白细胞精液症，排除外伤及遗传性疾病家族史，排除性功能障碍病史，体检未发现有明显睾丸、附睾及输精管异常。女性年龄≤36岁，排除结核、子宫内膜异位症及宫腔病变，获卵数8～15个。共取卵161个周期，移植123个周期。

二、洗精培养液的标本收集

在取卵当日手淫法采集精液，全部精液以Pure Sperm梯度离心法进行精液处理。于处理后将精子浓度调整为10×106/mL，留取标本（即洗精培养液）3份，每份1.0mL。第一份标本定为加精后0h（即在CO2培养箱内培养至该患者卵子加精时）检测，第二份标本定为加精后5h（即在CO2培养箱内培养至该患者卵子加精后5h后）检测，第三份标本定为加精后20h（即在CO2培养箱内培养至该患者卵子加精后20h后）检测，每份标本均用于检测过氧化氢（Hydrogen peroxide, H2O2）、过氧化氢酶（Catalase, CTA）的含量。

三、受精方法、分组、胚胎培养

每名患者取出的卵-冠-丘复合物（Oocyte corona cumulus complexes，OCCCs）随机分为两组：A组为短时受精，精卵共孵育5h后，将卵子转移至新鲜的受精培养液中。B组为长时受精，精卵共孵育过夜。两组均在OCCC取出后2～4h按精卵20 000～50 000:1的比例混合进行授精。授精后18～20h去掉卵子周围的颗粒细胞，清洗后转入卵裂培养基中，倒置显微镜下观察受精情况。见到原核（PN）形成即为受精，见2PN为正常受精，见＞2PN为多精受精。取卵后48h、72h观察胚胎发育情况，进行胚胎质量评分[1]。优质胚胎标准：取卵后72h胚胎细胞总数≥6且≤12个，卵裂球大小均匀或略不均匀，碎片≤20%。

四、受精培养液的标本收集

将转移卵子之后的受精液体（短时受精为5h，长时受精为20h）吸取到试管中，然后500×g，离心20min，吸取上清液，得到约1mL的受精培养液标本，用来检测H2O2、CTA的含量。

五、H2O2及CTA的含量测定

采用分光光度比色测定法进行测定。每份标本离心后取上清液，按试剂盒说明书操作，用分光光度计读取吸光度值。

六、胚胎移植、黄体支持及妊娠判断

取卵后72h为移植日，除外取消移植的患者38名，其余的123名患者随机分成两组，一组62人选择短时受精的胚胎进行移植，另外一组61人选择长时受精的胚胎进行移植。取卵日开始每日肌注黄体酮60mg支持黄体。胚胎移植后14d尿妊娠试验或血β-HCG确定生化妊娠，移植后28d B超见孕囊诊断临床妊娠。

七、统计学方法

结 果

一、授精后不同时间的洗精培养液中与两组受精培养液中活性氧之间的关系

无论是授精后5h，还是授精后20h，洗精培养液中H2O2水平均明显高于相应时间的受精培养液（P＜0.05），而CTA水平只在授精后5h明显低于短时受精的洗精培养液（P＜0.05），在授精后20h与长时受精之间没有明显差异（P＞0.05）。H2O2及CTA水平在授精后5h明显与短时受精呈正相关（r值分别为0.477和0.518,P＜0.05）；授精后20h的H2O2及CTA水平亦与长时受精呈明显正相关（r值分别为0.681和0.868,P＜0.05）。结果见表1、表2、表3。

受精率=受精卵子数/获得卵子数；多精受精率=多精受精卵子数/获得卵子数；卵裂率=形成胚胎数/受精卵子数；优胚率=优质胚胎数/2PN卵子数，植入率=种植胚胎数/移植胚胎数，临床妊娠率=临床妊娠周期数/移植周期数。B组的多精受精率明显高于A组（P＜0.05），A组的优胚率明显高于B组（P＜0.05），两组间的受精率、卵裂率、植入率、临床妊娠率无统计学差异，结果见表4。

表1 授精后5h洗精培养液中与短时受精受精培养液中活性氧之间的比较（n=161,x±s）

表1 授精后5h洗精培养液中与短时受精受精培养液中活性氧之间的比较（n=161,x±s）

与A组相比，P＜0.05

H2O2(mmol/L) CTA(U/mL) A 11.46±4.14 7.97±2.31 5h 22.53±5.51*5.01±1.72*t值 20.381 13.041P值 0.000 0.000*

表2 授精后20h洗精培养液中与长时受精受精培养液中活性氧之间的比较（n=161,x±s）

表2 授精后20h洗精培养液中与长时受精受精培养液中活性氧之间的比较（n=161,x±s）

与B组相比，*P＜0.05

H2O2(mmol/L) CTA(U/mL) B 24.11±15.52 1.84±0.85 20h 30.26±6.34*1.77±1.39t值 4.655 0.545P值 0.000 0.586

表3 授精后不同时间的洗精培养液中与两组受精培养液中活性氧之间的相关性(n=161)

表4 长时受精、短时受精两组间实验室参数及临床结局的比较 (%)

讨 论

在传统的体外受精操作过程中，卵子和精子共培养16～18h，为长时受精。这种受精方式能保证卵子有足够的时间受精，而且减少对卵细胞的观察和操作次数，也减少了卵细胞在培养箱外暴露的时间。但是有研究表明精卵孵化时间大于3h颗粒细胞可产生大量的氧化物质[2]。同时体外受精过程中高浓度精子亦会产生高水平活性氧，继而对胚胎发育造成影响。

活性氧（Reactive oxygen species, ROS）是氧离子、自由基和过氧化物等活性物质的统称。在生理情况下，活性氧的产生和清除保持动态平衡，机体具有使活性氧维持在细胞功能所必需的非常低的水平[3]。如果活性氧的产生速度超过了机体对其清除的能力，就使机体内活性氧产生堆积，机体则处于一种氧化应激状态。在生殖过程中，活性氧在精子获能、精卵受精等生理过程中发挥重要作用。本研究发现，无论是授精后5h，还是授精后20h，洗精培养液中H2O2水平均明显高于相应时间的受精培养液，即授精后5h明显高于短时受精的受精培养液，授精后20h明显低于长时受精的受精培养液；而CTA水平只在授精后5h明显低于短时受精的受精培养液。洗精培养液中H2O2水平均明显高于受精液的原因可能有两个：（1）精子本身可以产生活性氧，而H2O2是精子产生的主要活性氧类。受精培养液中加入的精子只有少量，原则上5 000～10 000条精子即可使一个卵子完成受精。在我们的研究中，每一个卵子加入了20 000～50 000条精子，因此，精子的浓度在洗精培养液中比在受精培养液中要高，故而产生的H2O2也会多。（2）有可能颗粒细胞能够产生一定量的CTA，可以分解部分H2O2，CTA水平在授精后5h明显低于短时受精的洗精培养液这一点可以解释这一推断。但颗粒细胞产生的CTA是有限的，随着作用时间的延长，CTA会被消耗掉，因此，CTA在授精后20h与短时受精之间没有明显差异。本研究还发现，H2O2及CTA水平在授精后5h明显与短时受精呈正相关；授精后20h的H2O2及CTA水平亦与长时受精呈明显正相关。这一结果验证了精子及颗粒细胞均可产生活性氧物质H2O2，并同时消耗颗粒细胞产生的CTA，因此，在长时受精过程中，卵子所处的环境具有高浓度的H2O2。高浓度的H2O2使得卵子处于氧化应激状态，不利于卵子的受精及受精卵的分裂。

在20世纪末期，Dirnfeld等[4]发现缩短精卵共孵育时间可提高胚胎质量和种植潜能，因此国内外一些中心开始了短时受精的研究。但结果并不一致。有研究认为短时受精可以提高优质胚胎率，改善妊娠结局[5-8]。但也有报道发现短时受精并没有这个优势[9-11]。本研究结果显示，长时受精组的多精受精率明显高于短时受精组，且短时受精组的优胚率明显高于长时受精组，两组间的受精率、卵裂率、植入率、临床妊娠率无统计学差异。结果与其他学者的研究有些一致，有些并不一致。这可能与各生殖中心实验室的技术方法、精卵共孵育时所加的精子量、研究设计及病例选择等不同有关。

综上所述，短时受精更符合人类自然生理条件，在不影响受精率的前提下，可以降低多精受精率，提高优胚率。而长时受精使卵子暴露于较高精子浓度的受精培养液中长达十多个小时，同时使卵子长时间暴露在高浓度的活性氧环境中，最终影响卵子质量，使异常受精率增高，优质胚胎率降低，不利于IVF的结局。因此，缩短精卵孵育时间可以使卵子尽早脱离高活性氧的环境，有利于胚胎的发育。

1 庄广伦. 现代辅助生殖技术. 北京: 人民卫生出版社, 2005: 58-59

2 Menezo Y, Barak Y. Comparison between day-2 embryos obtained either from ICSI or resulting from short insemination IVF: influence of maternal age.Hum Reprod2000; 15(8): 1776-1780

3 O'Flaherty C, de Lamirande E, Gagnon C. Positive role of reactive oxygen species in mammalian sperm capacitation: triggering and modulation of hosphorylation events.Free Radic Biol Med2006; 41(4): 528-540

4 Dirnfeld M, Bider D, Koifman M,et al. Shortened exposure of oocytes to spermatozoa improves in-vitro fertilization outcome: a prospective, randomized, controlled study.Hum Reprod1999; 14 (10): 2562-2564

5 Enkhmaa D, Kasai T, Hoshi K. Long-time exposure of mouse embryos to the sperm produces high levels of reactive oxygen species in culture medium and relates to poor embryo development.Reprod Domest Anim2009; 44(4): 634-637

6 屈宗银, 王凤英, 李玉艳, 等. 短时受精对体外受精结果的影响. 第三军医大学学报 2010; 32(16): 1785-1787

7 方伟芬, 冯贵雪, 张波, 等. 精卵孵育时间对胚胎质量的影响. 广西医学 2008; 30(9): 1333-1334

8 吴娟, 何晶晶, 章志国, 等. 短时IVF与传统IVF临床结果比较. 安徽医科大学学报 2013; 48 (2): 189-191

9 宋小兵, 张翠莲, 张钦宪. 不同脱颗粒细胞时间对IVFET治疗周期的影响. 当代医学 2013; 19(15): 40-41

10 Barraud-Lange V, Sifer C, Pocate K,et al. Short gamete coincubation during in vitro fertilization decreases the fertilization rate and does not improve embryo quality: a prospective auto controlled study.J Assist Reprod Genet2008; 25(7): 305-310

11 乜照燕, 吴海峰, 甄秀丽, 等. 短时受精联合早期补救性卵胞质内单精子注射在重度畸形精子症患者中的临床应用. 中国男科学杂志 2014; 28(1): 29-33

（2014-01-20收稿）

Impact of ROS on the outcome of in vitro fertilization and embryo transfer in the incubation of oocytes and sperm*

Zhang Na1**,Zhang Yi1, Zhang Yaoheng2, Zhao Shibin1, Nie Zhaoyan1, Zhen Xiuli1, Li Yali3
1. The Fourth Hospital of Hebei Medical University, ShiJiaZhuang 050011, China; 2. Minmetals Hanxing Mine Bureau Hospital; 3. The People Hospital of HeBei Province

Zhang Na, E-mail: Email: 13833116806@163.com; Tel: 13833116806

Objective To analyze the relationship of reactive oxygen species between the sperm wash medium and insemination medium, and explore the effect of different incubation time on the outcome of in vitro fertilization and embryo transfer.MethodsOne hundred and sixty-one patients who underwent in vitro fertilization and embryo transfer for female infertility were recruited in the study. Three samples were collected after the semen of patients was pretreated with Pure Sperm. Each was def ned as 0h after insemination, 5h after insemination and 20h after insemination to detect of the content of H2O2and CTA. On the oocyte retrieval day, the OCCCs which retrieved from the same patient were divided into short-term fertilization group (group A) and long-term fertilization group (group B) according to incubation time. The concentrations of H2O2and CTA in insemination medium were detected respectively. On the embryo transfer day,the patients were divided into two groups: one group of patients chose short-term fertilized embryo to transfer, one group of patients chose long fertilized embryo to transfer.ResultsThe levels of hydrogen peroxide and catalase at 5h after insemination were positively correlated with those of group A(r=0.477, 0.518,P<0.05), and the levels of hydrogen peroxide and catalase at 20h after insemination were positively correlated with those of group B(r=0.681, 0.868,P<0.05). The levels of hydrogen peroxide at 5h, 20h after insemination were corresponding higher than that in the insemination medium of group A and group B signif cantly (P<0.05). The levels of catalase at 5h after insemination were lower than those in the insemination medium of group A signif cantly (P<0.05), but the levels of catalase at 20h after insemination had no difference with those in the insemination medium of group B(P>0.05). The polyspermy rate in group B was signif cantly higher than that in group A(P<0.05), and the high quality embryo rate in group A was signif cantly higher than that in group B(P<0.05). There were signif cant difference in fertilization rate, cleavage rate, implantation rate, clinical pregnancy rate between the two groups (P>0.05).ConclusionShorten the incubation time of oocytes and spermcould protect oocytes from the high reactive oxygen environment so as to improve the quality of embryos.

in vitrofertilization ; embryo transfer; reactive oxygen species

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.07.010

R 321-33

资助: 河北省卫生厅重点科技研究计划（编号：20110144）
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