白细胞精液症治疗前后精浆瘦素与精液常规、精子凋亡率的检测及相关性分析*

张 涛 陈 斌吕逸清 王鸿祥 胡 凯 金 炎杨 昊 冯 坦 黄燕平 韩银发 王益鑫 黄翼然

上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿外科, 上海市男科学研究所（上海 200001）

白细胞精液症治疗前后精浆瘦素与精液常规、精子凋亡率的检测及相关性分析*

张 涛 陈 斌**吕逸清 王鸿祥 胡 凯 金 炎杨 昊 冯 坦 黄燕平 韩银发 王益鑫 黄翼然

上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿外科, 上海市男科学研究所（上海 200001）

目的探索白细胞精液症患者治疗前后精液常规、精浆瘦素（Leptin）及精子凋亡率与正常人群的差异，并分析其相关性。 方法 随机选取2010年10月至2012年5月本院泌尿男科门诊的白细胞精液症患者80例（WBC组），另选取生育力及各项精液参数均正常的生育人群标本40份作为对照组，在患者治疗前及经治疗精液白细胞水平恢复正常后，采用计算机辅助精液分析系统（CASA）行精液常规检测、放射免疫法检测精浆Leptin、Annexin V+PI染色-流式计数法测定精子凋亡率。比较各参数的组间差异并分析其相关性。 结果 WBC组治疗前精子浓度及活力均低于对照组（P＜0.05，P＜0.01），精子凋亡率显著高于对照组（P＜0.01），精浆Leptin水平高于对照组（P＜0.05），精浆Leptin水平与精子凋亡率之间存在正相关性（r=0.678，P＜0.05），经治疗后精子活力显著增加（P＜0.01），凋亡率降低（P＜0.05），精浆Leptin水平亦明显下降（P＜0.05）。 结论 治疗前白细胞精液症患者精子浓度、活力下降，而精浆Leptin水平和凋亡率均有增加，精浆Leptin与精子凋亡率之间存在正相关性。治疗后精浆Leptin与精子凋亡率均出现下调，精液常规各项参数明显改善，提示Leptin可能参与了过量白细胞诱发精子细胞凋亡的途径。

白细胞精液症; 瘦素; 精子; 细胞凋亡

白细胞精液症是导致男性不育的重要病因之一，常由感染、自身免疫性疾病、吸烟、酗酒以及精索损伤等因素引起，其最常见的原因是生殖道感染，如前列腺炎、精囊腺炎、附睾炎、睾丸炎等。 Leptin是由肥胖基因编码的蛋白质类激素，对机体的能量代谢，免疫功能和炎症反应等生理活动具有重要的调节作用。近年来，不少研究还表明Leptin在下丘脑、垂体前叶、睾丸及精子等与男性生育密切相关的器官、组织和细胞中广泛存在，对生精功能及精子凋亡等生理过程具有重要调节作用[1-4]。但关于白细胞精液症患者精子凋亡率与Leptin间的关系等问题仍有待进一步深入了解。本研究通过比较白细胞精液症患者在抗炎治疗前后精液常规、精浆中Leptin的含量及精子凋亡率与正常组的差异，并分析其相关性，旨在对上述问题进行进一步探索。

材料与方法

一、研究对象

从2010年10月至2012年5月至本院泌尿男科就诊的男性不育患者中随机选取经过氧化物酶染色法明确诊断的白细胞精液症患者80例，在抗炎治疗前及口服药物治疗至精液中白细胞＜1×109/L后行各项检查（精液常规、精浆Leptin水平及精子凋亡率）。另选取年龄为22～38岁、无遗传及生殖系统疾病、性生活及精液各项参数均正常，并成功使女方怀孕的正常生育力男性的40份精液标本作为对照组。 实验组入选标准：（1）年龄为21～41岁男性。（2）性生活正常，未采取任何避孕措施2年以上未使女方怀孕，女方生育能力检查正常。（3）体检未发现明显睾丸、附睾及输精管异常。（4）无外伤及遗传性疾病家族史，无性功能障碍病史。（6）经过氧化物酶染色确诊精液中白细胞浓度＞1×109/L，（6）患者同意参加本次研究，依从性好。排除标准：（1）恶性肿瘤患者正接受放疗、化疗者。（2）其他致男性不育因素，如成人双侧隐睾、精索静脉曲张、染色体异常等。（3）患有急性疾病，严重慢性疾病。

二、实验方法

（一）精液标本收集

所有研究对象在留取精液前均禁欲2～7d，于本院取精室按标准步骤留取精液标本：排尿后洗净双手和阴茎，以手淫法将精液完整收集于专用的广口容器中。精液标本取出后立即放置于37℃水浴箱内，待精液充分液化后行精液常规分析。精液经3000g/min离心15min后分离出精浆、精子分别存于-80℃冰箱待统一检测。白细胞精液症组患者在精液中白细胞转阴后3个月分别再次按上述步骤留取标本，并同样处理保存。

（二）精液常规分析

精液标本经37℃水浴充分液化后，由专门检验人员按照《世界卫生组织人类精液及精子—宫颈粘液相互作用实验室检验手册（第四版）》标准，先在显微镜下目测分析，然后使用精液分析系统进行计算机辅助精液分析。每份标本检测均经两位检验员核校。

（三）Annexin V+PI法测定精子凋亡率

离心后新鲜的精子重新混悬于Annexin V/PI凋亡检测专用的Buffer液中；用Makler板计数后将密度调节为（10～20）×105/ mL，取上述细胞液100μL，加入5μL Annexin V及1μL PI试剂，室温下避光孵育15min，用流式细胞仪测定染色情况，激发波长为488nm，绿色荧光（480～530nm）采用FL1通道检测，红色荧光（575～630nm）采用FL2通道检测。将“AN+/PI-”群精子判定为早期凋亡精子；“AN+/ PI+”群精子判定为晚期凋亡精子；“AN-/PI+”群精子判定为坏死精子；“AN-/PI-”群精子判定为非坏死或凋亡精子。计算晚期期凋亡精子数占总精子数的比例。

（四）放射免疫法检测精浆Leptin

选用北京福瑞生物工程公司Leptin放射免疫测定试剂盒，按试剂盒说明进行操作，用上海核所日环光电仪器有限公司全自动放射免疫γ计数器 读数，使用SN695B型γ放射免疫计数测量系统（第二版）绘制标准曲线并计算样品浓度。

结 果

一、一般情况

WBC组患者年龄（27.23±8.53）岁，不育年限（3.68±1.53）年；对照组年龄（28.75±6.65）岁。WBC组与对照组在年龄、身高、体质、体质量指数方面均无统计学差异（P＞0.05）。

二、各组精液常规、精子凋亡率及Leptin检测结果

各组精液常规、精子凋亡率及Leptin检测结果见表1，采用Mann-Whitney Test分析比较任意两组间差异。各组间精液pH无统计学差异（P＞0.05）。WBC患者术前精子浓度、活力及活动率均低于对照组，精子凋亡率及精浆Leptin水平高于对照组，经治疗至精液中白细胞恢复正常后，精子浓度、活力及活率较治疗前有上升，精子凋亡率及Leptin水平亦明显下降，且差异有统计学意义；而WBC组治疗后的精子凋亡率高于对照组，差异具统计学意义，而精液参数及Leptin水平与对照组相比差异无统计学意义。

表1 WBC患者手术治疗前后与对照组精液常规与精子凋亡检测结果比较

图1 WBC组治疗前后与对照组精子凋亡率检测图

三、各组精子凋亡率检测结果

精子凋亡率检测结果如图1所示。WBC组治疗前精子凋亡率高于治疗后及对照组（P＜0.05，P＜0.01）。

四、精浆Leptin与精子凋亡率的相关性分析

采用Spearman等级相关法分析精浆Leptin与精子凋亡之间的相关性，结果如下：

WBC组：精浆Leptin水平与精子凋亡率之间存在正相关性，（r=0.678，P＜0.05）。

对照组：精浆Leptin水平与精子凋亡率之间无显著相关性，（r=0.368，P＞0.05），见表2，图2。

表2 精浆Leptin与精子凋亡率相关性分析

讨 论

白细胞精液症是导致男性不育的主要原因之一，在男性不育中约占10%～20%。其病因是多方面的：感染、自身免疫性疾病、吸烟、酗酒、精索损伤等均可导致精液中出现过量白细胞，而泌尿生殖系统感染和免疫功能异常是白细胞精液症的最常见病因[5]。大量研究表明：在白细胞精液症患者中，作为第一道防御机制的中性粒细胞或巨噬细胞可通过吞噬作用、分泌炎性因子、刺激生殖道局部产生抗精子抗体及产生大量ROS等多种途径导致精子质量、存活率和活力的下降，从而导致男性不育[5-7]。因此，对精液中自细胞的检出有广泛的临床参考价值。

图2 精浆Leptin与精子凋亡率的相关性示意图

Leptin是体内广泛存在的一种蛋白类激素，主要由白色脂肪组织细胞产生，对机体能量代谢、青春期的启动、血管生成、免疫功能和炎症反应等生理过程均有一定的调节作用。在对细胞凋亡调控方面，目前已明确诱发脂肪细胞凋亡是Leptin参与调节体质量的重要方式之一。后期的研究进一步表明，Leptin促凋亡的功能不仅限于脂肪细胞，更可通过不同途径诱导多种细胞的凋亡：如通过与受体结合[8]或促进一氧化氮（Nitric oxide，NO）及氧自由基的生成，引起内皮细胞凋亡[9]；通过抑制DNA合成，促进垂体瘤细胞的凋亡[10]；通过上调前列腺素E2来促进肾小管细胞的凋亡等[11]。近年来，Leptin在生殖系统及生精过程中的所发挥的作用日益受到人们的重视。已有研究发现少、弱精子症患者的精浆Leptin水平高于精液参数正常男性，且Leptin在睾丸中的表达与精子生成障碍有关[12,13]；还有研究表明精浆中Leptin水平与精子活力及快速前向运动精子比例呈负相关[14,15]。我们前期对VC患者及动物模型的研究中也有类似结果[16,17]。在Leptin与精子细胞凋亡方面，有文献报道内分泌紊乱及Leptin自身表达异常可激活caspase依赖的生精细胞凋亡通路[18,19]，我们在研究中还发现在睾丸生精功能受损患者精浆Leptin及精子凋亡率均明显增高的同时，精浆活性氧水平及与精子凋亡密切相关的Omi/HtrA2蛋白也显著增高，提示Leptin参与了氧化应激诱导的精子凋亡信号通路，而其具体机制仍有待进一步深入研究。

本研究的结果证实白细胞精液症患者精浆Leptin水平与精子凋亡密切相关。临床上一般通过抗感染、抗氧化等方法治疗白细胞精液症。我们的研究还发现白细胞精液症患者经治疗白细胞恢复正常后患者精浆Leptin与精子凋亡率均出现下调且精液常规各项参数出现了明显的改善。以上结果提示Leptin参与了精浆中过量白细胞诱导精子凋亡的病理过程。关于白细胞精液症患者中Leptin参与精子凋亡的相关信号通路的具体机制及相互关系，以及干预Leptin参与的精子凋亡信号通路在辅助生殖中对提高受孕率、妊娠率及胚胎质量是否有所帮助，将是值得关注和进一步深入研究的课题。

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（2013-08-28收稿）

Test and correlation analysis of seminal Leptin, sperm parameters and apoptosis in leukocytospermia patients*

Zhang Tao, Chen Bin**, Lv Yiqing, Wang Hongxiang, Hu Kai, Jin Yan, Yang Hao, Feng Tan, Huang Yanping, Han Yingfa, Wang Yixin, Huang Yiran Department of Urology, Shanghai Institute of Andrology, Ren Ji Hospital, School of Medicine Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200001, China

Chen Bin, E-mail: binchen@263.sina.com

ObjectiveTo detect the seminal Leptin level, sperm parameters and sperm apoptosis rate of leukocytospermia patients before and after treatment, and explore their correlation.MethodsTotal of 80 leukocytospermia patients(WBC group)were randomly recruited in the study and their sperm samples were collected before and after treatment. Other 40 normal sperm samples were collected as the controls. The sperm parameters were detected by computer assisted sperm analysis (CASA). The level of semen plasma Leptin was measured by RIA and the sperm apoptosis rate were assessed by AnnexinV/PI staining-FACS.ResultsSperm concentration and viability in WBC group before treatment were all obviously lower than those of the control (P<0.05,P<0.01), whereas the apoptosis rate was signif cantly higher(P<0.01). The level of semen plasma Leptin was higher than that of the control (P<0.05), moreover itwas positively correlated withsperm apoptosis rate (r=0.678，P<0.05). After treatment, semen activity was increased and sperm apoptosis rate and Leptin level were decreased in WBC group. Conclusion Increase inseminal Leptin level and sperm apoptosis rate were founded in WBC group, which may be contributed to the decrease of sperm concentration and viability. Positive relationship between seminal Leptin and sperm apoptosis was found, implyingthat Leptin might play a role in sperm apoptosis by increasing seminal leukocyte.

leukocytospermia; leptin; spermatozoa; apoptosis

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.07.009

R 698.2

资助: 国家自然科学基金资助（课题编号：81270741）; 上海市浦东新区卫生系统重点学科群建设项目（PWZxkq2010-03）
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, E-mail: binchen@263.sina.com