蜂毒肽对前列腺癌PC-3细胞凋亡诱导的影响*

吕立国白遵光**张 娴吴巧玲陈志强王昭辉代睿欣王树声

1. 广东省中医院泌尿外科（广州 510120）; 2. 广东省中医院中心实验室; 3. 广东省中医院肿瘤科

蜂毒肽对前列腺癌PC-3细胞凋亡诱导的影响*

吕立国1白遵光1**张 娴2吴巧玲3陈志强1王昭辉1代睿欣1王树声1

1. 广东省中医院泌尿外科（广州 510120）; 2. 广东省中医院中心实验室; 3. 广东省中医院肿瘤科

目的研究蜂毒肽（Melittin）对人前列腺癌PC-3细胞凋亡的影响及可能机制。方法实验设立空白对照组和蜂毒肽不同浓度组，用MTT方法检测细胞增殖，Hoechst 33258染色检测细胞凋亡，RT-PCR检测p27、p53 mRNA表达，Western blot检测蛋白表达。结果与对照组比较，蜂毒肽作用24、48、72 h后，4、8、16、32μg/mL组MTT检测OD值明显降低，细胞凋亡率明显增高（P＜0.05），作用48h后，p27、p53 mRNA表达明显升高（P＜0.05），p53和 Caspase3蛋白含量增高。结论 蜂毒肽对PC-3细胞有凋亡诱导作用，其作用机制可能与增高p27、p53、Caspase3表达相关。

蜂毒肽; 前列腺肿瘤; 细胞系, 肿瘤; 细胞凋亡

目前在世界范围内前列腺癌发病率正居男性恶性肿瘤的第二位[1]，在美国，发病率占男性恶性肿瘤的第一位。确诊时多为晚期。内分泌治疗是晚期前列腺癌的主要治疗方法，但经过中位时间14～30个月后，几乎都会发展为去势抵抗性前列腺癌（CRPC），中位生存期短。如何延缓晚期前列腺癌进展为CRPC、如何延长CRPC生存期，是世界范围内的治疗难点。中医药治疗CRPC逐渐成为研究的热点。本研究拟结合现代医学研究成果，探讨蜂毒肽对PC-3细胞凋亡的影响及其作用机制，为进一步的临床应用提供理论依据，为CRPC的治疗提供思路。

材料和方法

一、试验药物

蜂毒肽,购于美国Sigma公司, 纯度91.8%，批号：060M4079V。用培养基稀释至终浓度为：1、2、4、8、16、32μg/mL。

二、细胞

前列腺癌PC-3细胞，购于中山大学实验动物中心细胞实验室。

三、试剂

四氮甲基唑蓝（MTT），美国Sigma公司；DMEM培养基、胎牛血清、0.25%胰酶消化液，美国Hyclone公司；Annexin V/PI凋亡检测试剂盒,RNA提取试剂Trizol，美国Invitrogen公司；逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒，Takara公司。 所用化学试剂均为分析纯，购于广州化学试剂厂。

四、仪器

酶标仪(美国Perkin Elmer公司），流式细胞仪（美国Beckman Coulter公司，FC500），7500实时荧光定量基因扩增系统（美国ABI公司），凝胶成像系统（美国Bio-Rad公司）。

五、方法

前列腺癌PC-3细胞用含5%FBS的DMEM，37℃，5% CO2，饱和湿度恒温培养箱培养，0.25%胰酶消化传代。实验设蜂毒肽1、2、4、8、16、32μg/ mL组和空白对照组，作用时间为24，48，72h。各实验均重复3次。

（一）MTT实验

细胞消化后计数，接种至96孔培养板，每孔100μL，设5个复孔，细胞贴壁后加入作用药物，培养24，48，72h后加入5%MTT溶液20μL，继续培养4h，后吸去上清，每孔加入100μL DMSO溶液，室温振荡溶解10min后，酶标仪检测570nm波长的OD值。细胞增殖抑制率=（对照组OD值-药物组OD值）/对照组OD值×100%。

（二）Hoechst 33258染色检测细胞凋亡

细胞接种于6孔板中，按上述各组处理进行培养。作用完成后，加入Hoechst 33258染液按照说明进行细胞染色，用倒置荧光显微镜检测细胞凋亡率。

（三）RT-qPCR检测mRNA表达

细胞分组处理后，收集细胞用Trizol提取总RNA，测定浓度后逆转录合成cDNA，用SYBR Green染料法荧光定量PCR（Real Time PCR）检测，并用内参基因GAPDH进行校正分析p53 mRNA表达含量。引物序列如下：p53基因前向引物： 5’-ATGT GCTGTGACTGCTTGTAGATG-3’，逆向引物：5’-TCAACAAGATGTTTTGCCAACT-3’；GAPDH前向引物：5’-TCTTTTGCGTCGCCAGCC GA-3’，逆向引物：5’-AGTTAAAAGCAGCCCTGGTG ACCA-3’； p27kip前向引物：5’- AGTGTCTAAC GGGAGCCCTA -3’，逆向引物：5’- CCGGGTT AACTCTTCGTGGT-3。

六、统计分析方法

结 果

一、MTT检测结果

与对照组比较，蜂毒肽在4、8、16、32μg/mL浓度作用后，OD570nm明显降低，提示蜂毒肽能抑制PC-3细胞增殖或能促进细胞凋亡，其中浓度8、16、32μg/mL组之间作用效果无明显差异，故后续选用1、4、8μg/mL作为实验浓度（见图1）。

图1 蜂毒肽对PC-3细胞增殖影响

二、Hoechst染色结果

蜂毒肽能诱导细胞凋亡，在作用48h后，与对照组比较，1μg/mL组无明显凋亡，4μg/mL组细胞凋亡率明显升高，浓度8μg/mL时，细胞凋亡率＞70%，（见图2）。

三、RT-PCR实验结果

发现蜂毒肽作用后，PC-3细胞p53和p27蛋白的相对表达量明显增加（见图3）。

四、 Western blot 实验

在蜂毒肽作48h后， 1μg/mL、4μg/mL、8μg/ mL组细胞p53表达均增高， 4μg/mL、8μg/mL 组Procaspase3活化剪切增多，Caspase3含量增高，凋亡增加（见图4）。

图2 蜂毒肽对PC-3细胞凋亡的影响

图3 Mel诱导PC-3细胞p27、p53 mRNA表达

图4 蜂毒肽对PC-3细胞p53、Caspase蛋白表达的影响

讨 论

蜂针疗法是中医传统疗法，具有抗肿瘤的作用，初步临床研究显示，蜂针疗法在控制前列腺癌进展方面有潜在的作用。蜂毒肽是蜂毒的主要成分，具有多种抗肿瘤作用[2]，实验研究证实，蜂毒肽对前列腺癌细胞具有增殖抑制和凋亡诱导作用，并揭示了部分可能的作用机制[3,4]。目前研究已经明确的前列腺癌细胞增殖与凋亡的调控机制很多，包括Bcl-2/bax失衡[5]、P53蛋白过表达[6]、凋亡抑制基因Survivin过表达[7,8]、Caspase通路[9,10]等。为进一步明确蜂毒肽对前列腺癌细胞的作用及机制，我们进行了上述实验。

实验结果证实，与对照组比较，作用24、48、72 h后，蜂毒肽对PC-3细胞有明显的抑制增殖作用，在浓度4、8、16、32μg/mL作用48 h后，PC-3细胞凋亡和死亡细胞数量均明显增多，表明蜂毒肽对前列腺癌PC-3细胞具有凋亡诱导作用。进一步研究发现，蜂毒肽处理后的PC-3细胞p27、p53 mRNA的表达量明显升高，推测p27、p53调控是其凋亡诱导作用途径之一。

p27是细胞周期的负性调控因子，被认为是抑癌基因。在正常细胞和肿瘤细胞中，p27通过抑制细胞周期依赖性蛋白激酶的活性负性调节细胞周期的进程，抑制细胞增殖。也有研究发现p27参与细胞分化调控，诱导细胞凋亡[11]。由此推测，蜂毒肽可以通过调控p27表达诱导PC-3细胞凋亡。

p53是一种抑癌基因，能够通过多种机制阻止肿瘤发展它也是一种转录因子，一种生长抑制性蛋白，在前列腺癌发生发展中起重要作用。研究[12]证实，p53蛋白可诱导PC-3细胞凋亡，PC-3细胞存在依赖p53的凋亡途径。本实验发现，蜂毒肽处理后p53表达明显升高，由此推测，通过调控p53表达诱导PC-3细胞凋亡，是蜂毒肽诱导PC-3细胞凋亡的作用途径之一。p53可以激活导致Procaspase3 的剪切生成有活性的Caspase3。

Caspases是在细胞凋亡中起重要作用的同源蛋白，是细胞凋亡的中心环节，对细胞凋亡起着重要作用。其中Caspase-3是细胞凋亡过程中激活的关键激酶，也是细胞凋亡的主要效应因子，是细胞凋亡的执行者，是细胞凋亡过程中最主要的终末剪切酶，也是CTL细胞杀伤机制的重要组成部分。Caspase-3蛋白与进展性前列腺癌细胞的耐凋亡特征、恶性程度和复发性有关。Caspase-3的低阳性率与进展性前列腺癌的发生、发展和预后有密切联系[13]。 Caspase-3活性下降，与激素非依赖性前列腺癌发生和进展过程相关[14]。研究显示，某些中药提取物[15,16]可以通过上调Caspase-3表达，抑制PC-3细胞的增殖。本实验显示，蜂毒肽作用后Caspase-3含量增高，由此推测，Caspase-3通道也是蜂毒肽对PC-3细胞发挥凋亡诱导作用的途径之一。

总之本实验揭示了蜂毒肽对PC-3细胞的凋亡诱导作用及可能的机制，为蜂针疗法进一步的临床应用提供了理论依据，蜂毒肽对PC-3细胞凋亡诱导作用是否存在其他途径，如何在此基础上开展结合蜂毒肽的前列腺癌生物治疗，有待进一步的深入研究。

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3 Park MH, Choi MS, Kwak DH,et a1. Anti-cancer effect of bee venom in prostate cancer cells through activation of caspase pathway via inactivation of NF-κB.Prostate2011; 71(8): 801-812

4 Russell PJ, Hewish D, Carter T, et al. Cytotoxic properties of immunoconjugates containing melittin-like peptide 101 against prostate cancer: in vitro and in vivo studies. Cancer Immunol Immunothera 2004; 53(5): 411-421

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10 杨国胜, 陈昭典. 激素抵抗性前列腺癌细胞增殖凋亡及Caspase-3活性的观察. 中国男科学杂志 2009; 23(9): 30-34

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14 杨国胜, 陈昭典. 激素抵抗性前列腺癌细胞增殖凋亡及Caspase-3活性的观察. 中国男科学杂志 2009; 23(9): 30-34

15 邹明畅, 崔飞伦, 盛玉清, 等. 昆布多糖硫酸酯对非激素依赖型人前列腺癌PC-3细胞及bcl-2、Caspase-3基因表达的影响. 中草药 2010; 41(1): 99-103

16 张鹏, 王子明, 纪宗正, 等. 苦参碱抑制人雄激素非依赖性前列腺癌细胞系PC-3细胞增殖和诱导凋亡机制的研究. 中国男科学杂志 2009; 23(8): 2-5, 18

（2014-07-23收稿）

Effects of Melittin on apoptosis of prostate cancer cell PC-3*

Lv Liguo1, Bai Zunguang1**, Zhang Xian2, Wu Qiaoling3, Chen Zhiqiang1, Wang Zhaohui1, Dai Ruixin1, Wang Shushing11. Department of Urology, Guangdong Province Hospital of Tranditional Chinese Medicine, Guangzhou 510120,
Guangdong, China; 2.Central Laboratory, Guangdong Province Hospital of Tranditional Chinese Medicine;
3. Department of Oncology, Guangdong Province Hospital of Tranditional Chinese Medicine

Bai Zunguang, E-mail: zunguangbai@163.com

ObjectiveTo study the effects of Melittin (Mel) on apoptosis of prostate cancer cell PC-3 and explore its potential mechanism.MethodsBlank control Group and Mel groups of different concentrations were set up in this study. Cell proliferation was analyzed by MTT assay. Cell apoptosis was measured by Hoechst 33258 dying method. The expressions of p27and p53were detected by RT-qPCR, and their protein expressions were detected by Western blot.ResultsCompared with those of the controls, cell proliferation (OD value) decreased and apoptosis increased signif cantly in Mel groups of 4, 8, 16, 32μg/mL after 24, 48 and 72 h treatment. After 48h treatment, the expressions of p27 andp53 mRNA were increased signif cantly, and protein expression of p53 and caspase3 were also increased.ConclusionMel may induce PC-3 cell apoptosisby upregulation of p27, p53 and caspase3 expression.

melitten; prostatic neoplasms; cell line, tumor; apoptosis

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.09.003

R 737.25

资助: 广东省科技计划项目（2012B061700035）
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, E-mail: zunguangbai@163.com