小鼠Bin1b真核表达载体pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b构建及在真核细胞HEK293中的表达*

周 波 孙中义靳风烁 李彦锋 张 军 张克勤第三军医大学大坪医院野战外科研究所泌尿外科（重庆 400042）

·论 著·

小鼠Bin1b真核表达载体pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b构建及在真核细胞HEK293中的表达*

周 波 孙中义**靳风烁 李彦锋 张 军 张克勤
第三军医大学大坪医院野战外科研究所泌尿外科（重庆 400042）

目的构建表达小鼠抗菌肽蛋白（Bin1b）的真核表达载体pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b，对其在HEK293细胞中的表达进行检测分析。方法应用PCR方法获得Bin1b的cDNA片断，将其插入pSG.SS.C3d3.YL中，经酶切鉴定正确后转染HEK293细胞，利用间接免疫荧光结合激光共聚焦技术、Western blot技术、免疫组织化学染色技术及流式细胞仪检测技术对Bin1b的表达进行检测。结果构建成功后的pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b在HEK293细胞中能够表达Bin1b。 结论 Bin1b在真核细胞中的成功表达为后续研究Bin1b的高表达对受精过程的影响奠定了基础。

真核细胞; 遗传载体; 基因表达; 荧光抗体技术, 间接

附睾对精子成熟、储存和保护的作用因具有以下两个最重要的特点而早已经被认同，并被视为进行抗生育的一个理想的靶器官[1,2]。这两个特点一是功能较为单一，干扰功能的药物不致引起严重的副作用。二是精子在进入附睾前已经分化完全，基因转录已经停止，其成熟功能的获得一般与蛋白质修饰有关，不涉及DNA复制机能，因此干扰药物不会引起DNA改变的遗传病。抗菌肽蛋白（Bin1b，或SPAG11）自附睾头部中段的上皮细胞中分泌入管腔后与还没有运动能力的精子结合，通过L型钙离子通道使精子摄取钙离子，“起始”精子运动[3,4]。因此，Bin1b极有可能成为免疫节育疫苗的理想靶抗原。上个世纪90年代后期发现2或3个串联的补体C3裂解片段C3d具有强烈的免疫佐剂效应，可大大提高抗原的免疫原性[5]。因此本研究利用了补体领域的这一重要发现，以Bin1b作为研究目标，引入C3d作为分子内佐剂，制备含有Bin1b和串联的3个C3d（C3d3）融合基因的真核重组表达载体pSG.SS.C3d3. YL-Bin1b，并对其在真核细胞中的表达进行鉴定。

材料与方法

一、菌种、质粒和试剂

大肠杆菌DH5α为本室保存菌种、含Bin1b基因编码序列的重组载体pYA3149-Bin1b由李彦锋博士惠赠，空载体pSG.SS.YL和pSG.SS.C3d3.YL由梁培禾博士惠赠。HEK293细胞和Raji细胞购自美国菌种保藏中心（American Type Culture Collection, ATCC）。分子生物学操作所用工具酶购自日本TaKaRa公司，质粒提取试剂盒、胶回收试剂盒、PCR产物纯化试剂盒购自美国Omega公司，胰蛋白胨、酵母提取物购自英国Oxford公司，琼脂粉、琼脂糖等购自上海生工生物技术服务有限公司，DMEM购自美国Gibco公司，引物由上海鼎安生物科技有限公司合成，脂质体转染剂Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司。抗Bin1b羊抗多克隆抗体购自美国Santa Cruz 公司（SPAG11A/ B， K-13，sc-103236），SP9000免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥生物技术有限公司，FITC标记的兔抗羊IgG购自武汉博士德生物工程有限公司。

二、方法

（一）引物设计

根据Bin1b 结构将引物设计为：Forward primer：TGCACAGAGAGCGAGCCGTA，Reverse primer：ATGCACCGTCAGCCACACAT，所对应的碱基为第35至第370bp，目的条带为336bp。在以上引物前端分别添加限制性内切酶BglⅡ（AGATCT）和BamHⅠ识别序列（GGATCC），并添加保护性碱基各2个（GA和CG），得以下结果：Forward primer：5’-GAAGA TCTTGCACAGAGAGCGAGCCGTA-3’ （插入BglⅡ酶切位点）；Reverse primer：5’-CGGGATCCATGC ACCGTCAGCCACACAT-3’ （插入BamHⅠ酶切位点）；如此所得的目的条带为336+6+2+6+2=352 bp。

（二）Bin1b基因扩增和重组载体pSG.SS.C3d3. YL-Bin1b的构建

以pYA3149-Bin1b为模板进行PCR反应（94℃30s，55℃ 30s，72℃ 60s共30个循环）获得352bp大小的目的片段。BglⅡ分别酶切PCR产物和pSG. SS.C3d3.YL，用PCR产物纯化试剂盒进行回收，对回收产物分别用BamHⅠ进行再酶切，0.8%琼脂糖凝胶电泳酶切产物后，紫外灯下分别切割含目的片段和载体的凝胶，胶回收试剂盒进行回收。T4 DNA连接酶连接胶回收产物（16℃，1h）并转化连接产物至DH5α，挑取单菌落进行质粒扩增。用BglⅡ和BamHⅠ双酶切鉴定正确后的重组质粒命名为pSG. SS.C3d3.YL-Bin1b。

（三）pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b转染HEK293细胞

按2×105细胞/孔接种人胚肾HEK293细胞至铺有盖玻片的六孔板中，待细胞长至90%融合时以空载体pSG.SS.C3d3.YL为对照进行转染。具体方法为：（1）将10μg DNA用250μL无抗无血清DMEM稀释并混匀后，室温孵育5min；（2）用240μL无抗无血清DMEM稀释10μL Lipofectamine 2 000并混匀后，室温孵育5min；（3）将以上（1）和（2）中混合液进行混和即成转染混合液，室温孵育15min；（4）将六孔板中培养液换用1mL无抗无血清DMEM，加入转染混合液，并轻柔混匀，置于CO2培养箱中（37℃，5%CO2）孵育；（5）4h后，弃去培养液，换用含10%小牛血清之DMEM继续培养。

（四）Bin1b表达的间接免疫荧光检测

转染完成48h后，取出盖玻片，冰丙酮固定5min，根据SP9000试剂盒进行酶修复与抗原封闭，加入Bin1b抗体（1:400），孵育40min，PBS洗去抗体，加入FITC标记的抗羊IgG（1:500稀释）室温孵育30min，荧光显微镜观察结果。

（五）Western blot 鉴定

收集转染细胞培养上清，离心后装入透析袋，置于PEG6000固体中，将上清液浓缩50倍，利用紫外分光光度法进行蛋白定量，并用上样缓冲液稀释至2500μg/mL后进行SDS-PAGE电泳。首先灌制聚丙烯凝胶，灌药时先灌下层的分离胶，再灌上层的浓缩胶，然后再上样（每孔50ug/20μL）进行蛋白电泳（电压浓缩胶为90V，分离胶为140V）。电泳结束后，进行PVDF膜电转，100V恒压电转1h，移入4℃冰箱20V电转过夜。取出PVDF 膜，放入加有封闭液的密封塑料袋中，室温摇动4 h。洗膜后加入Bin1b抗体（1:400），室温摇动1h，加入二抗（HRP标记抗羊IgG，1:1000稀释），室温摇动1h，洗膜后显影；将PVDF 膜置于NEN化学发光试剂中反应1～3min；在暗室中使X 光片曝光，常规方法显影和定影。

（六）免疫细胞化学染色鉴定

盖玻片多聚赖氨酸包被后置于6孔细胞培养板中，然后将处于对数生长期的HEK293细胞接种于其中，同前进行质粒转染；转染后继续培养过程中，细胞爬附于盖玻片上。 冷丙酮固定5～10min，0.3% H2O2甲醇溶液（新鲜配制）室温浸泡30min。5ml/L Triton-X 100 在4℃条件下通透细胞膜2min。 正常山羊血清室温下封闭20min，甩去多余液体。 滴加一抗（1:500），室温孵育40min，滴加二抗（HRP标记抗羊IgG，1:400稀释），37℃孵育0.5 h。DAB显色。苏木素复染10s，盐酸酒精分化，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。显微镜下观察，以胞浆内出现明确棕黄色颗粒判定为阳性，照相记录。

（七）流式细胞仪鉴定

Raji 细胞膜上具有丰富的 CD21分子（C3d 受体），把其与不同表达产物共孵育，间接免疫荧光染色标记Bin1b抗原，只有当Bin1b与C3d3为融合蛋白时，才能使Raji 细胞荧光标记为阳性，利用流式细胞仪测定阳性细胞比例。具体方法如下：获取不同质粒转染细胞培养上清，各取150μL与Raji细胞37℃孵育1h。PBS漂洗后滴加一抗，500μL重悬细胞，室温孵育45min。 PBS漂洗后滴加二抗（FITC标记抗羊IgG，1:200稀释）重悬细胞，室温孵育45min。PBS重悬细胞后进行流式细胞仪检测。

结 果

一、PCR法获得Bin1b基因

利用PCR法，成功获取了约352bp的目的片段，酶切后结果见图1。

二、重组载体pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b的鉴定

为鉴定构建的重组载体是否正确，对提取后的质粒pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b用BglⅡ和BamHⅠ双酶切进行鉴定。0.8%琼脂糖凝胶电泳酶切结果（图2）显示，近352bp处的条带为酶切后的目的片段，测序结果也显示该片段为Bin1b编码基因，表明pSG. SS.C3d3.YL-Bin1b构建成功。

三、重组载体pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b表达检测

以pSG.SS.C3d3.YL空载体的免疫荧光结果为阴性相比，pSG.SS.YL-Bin1b和pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b的表达结果显示大量目的蛋白表达于胞浆和胞核中，表明真核细胞中Bin1b 表达成功，见图3。

四、Western blot检测结果

质粒pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b及pSG.SS.YL-Bin1b转染HEK293细胞后，Western blot检测显示细胞培养上清中存在分子量分别为116kD及6 kD分子量的表达产物，与Bin1b-C3d3融合蛋白及Bin1b蛋白理论分子量（5.8KD）接近；质粒pSG.SS.YL转染后无可与抗Bin1b抗体结合的蛋白产物表达，见图4。

图1 Bin1b PCR产物经BglⅡ和BamHⅠ酶切电泳结果

图2 pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b和pSG.SS.YL-Bin1b酶切鉴定电泳结果

图3 不同Bin1b重组载体蛋白表达荧光检测结果

图4 不同重组质粒转染HEK293细胞后培养上清中表达产物的Western blot分析

五、免疫细胞化学染色结果

重组质粒转染HEK293细胞后，免疫细胞化学染色检测Bin1b表达，pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b为强阳性，pSG.SS.YL-Bin1b为阳性，见图5。

六、流式细胞仪检测结果

重组质粒pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b、pSG.SS.YLBin1b及pSG.SS.YL转染HEK293细胞后，用流式细胞仪检测与不同培养上清共孵育后的Raji细胞表面Bin1b抗原存在情况，显示前者荧光标记阳性细胞比例高达89.2%，而后两者仅为8.5%和3.5%（图6），说明重组质粒可表达融合蛋白，且其中Bin1b可被相应抗体识别，而C3d与其受体结合的功能也未受到影响。

讨 论

图5 转染HEK293细胞后Bin1b免疫细胞化学分析 ×200

图6 Raji细胞表面 Bin1b抗原流式细胞仪检测结果

目前虽然国内外已有多种方式用于控制生育，但仍缺乏能为两性所普遍接受的理想避孕措施，因而开发新的安全、高效、方便、廉价、可逆的避孕方法仍是当前生殖与避孕研究领域的焦点问题之一。目前世界上所采用的避孕措施主要以女性为主，有关避孕药物还不完善，有致畸、肝脏毒性等副作用，其遗传后果还有待进一步评估。男性主动参与避孕将很好促进男女平等和社会进步[6]，目前可供男性选择的避孕措施中雄性免疫避孕疫苗更具有重要意义[7]。

睾丸和附睾受到生理屏障保护，机体的免疫系统不识别自身的睾丸和附睾蛋白。当这些蛋白进入血液中，机体的免疫系统就因为从来都不认识这种物质而把它们当成外来入侵者，从而产生抗体以消灭和阻截它们。Bin1b自附睾头部中段的上皮细胞中分泌入管腔后与还没有运动能力的精子结合，通过L型钙离子通道使精子摄取钙离子，“起始”精子运动。张永莲院士将附睾头部未成熟的精子和附睾头部上皮细胞（含Bin1b）或转染了Bin1b的小肠上皮细胞共培养，发现能够促进精子的运动，但加入Bin1b的抗体后则无此效果；他们还在从附睾尾部取得的成熟精子中加入Bin1b的抗体，结果显示精子的活动能力受影响不大。说明Bin1b能启动未成熟精子的运动能力，但对维持成熟精子的活动不起主要作用[8]。研究还排除了附睾头部其他分泌因子参与未成熟精子前向运动能力的获得，将Bin1b的cDNA转染到结肠上皮细胞系T84，构建稳定表达Bin1b的Bin-T84细胞系和空载体转染的对照组Vet-T84细胞系，然后同样将两者与不游动的未成熟精子共培养。可以发现在精子运动力增加、前向运动百分比增加和这些时相分布上，Bin-T84细胞与精子共培养和附睾头部细胞与精子共培养相似，相对照的Vet-T84细胞精子共培养则没有显著增加。因此Bin1b参与了精子成熟中未成熟精子开始获得前向力这一关键点[8]。

C3d 与B 细胞和滤泡树突状细胞（FDC）上的受体（CR2 ,CD21）的相互作用对于正常体液免疫应答的诱导和维持至关重要。自从1996 年Thornton 等[9]报道C3d 是一个能显著增强体液免疫效力的分子佐剂以来，此后许多研究相继证实C3d 是具有巨大潜能的疫苗佐剂。分子佐剂C3d 通过与抗原分子的偶联，能够提高抗原的免疫原性，降低B 细胞的活化阈值，增强免疫应答的强度[10]。

基于目前的研究现状，本实验中我们构建了能够在真核细胞中表达的重组载体pSG.SS.C3d3.YLBin1b，结果证实构建成功。正确的碱基序列是DNA疫苗接种后能正确表达并发挥作用的关键，对转录、翻译后修饰等方面更具有重要意义。因此，应对表达产物加以分析验证，Western blot结果显示可见有116kD的条带，符合Bin1b-C3d3融合蛋白的理论分子量值。用抗Bin1b的抗体进行免疫组织化学染色，无论是直接检测转染细胞，还是先将表达产物与存在C3d受体的Raji 细胞共孵育后再进行检测，均为阳性反应，说明无论单体还是融合蛋白中Bin1b部分免疫识别表位保持良好，而C3d部分也未因与Bin1b的耦联而丧失其与受体结合的生物学活性，表明该重组质粒转染真核细胞后能够正确表达。

综上所述，本研究成功构建的pSG.SS.C3d3.YLBin1b能够在真核细胞内进行表达，为后续研究Bin1b的高表达对受精过程的影响奠定了基础。

1 Perobelli JE, Alves TR, de Toledo FC, et al. Impairment on sperm quality and fertility of adult rats after antiandrogen exposure during prepuberty. Reprod Toxicol 2012; 33(3): 308-315

2 Chabory E, Damon C, Lenoir A, et al. Mammalian glutathione peroxidases control acquisition andmaintenance of spermatozoa integrity.J Anim Sci2010; 88(4): 1321-1331

3 Cao D, Li Y, Yang R,et al.Lipopolysaccharide-induced epididymitis disrupts epididymal beta-defensin expression and inhibits sperm motility in rats.Biol Reprod2010; 83(6): 1064-1070

4 Li P, Chan HC, He B,et al. An antimicrobial peptide gene found in the male reproductive system of rats.Science2001; 291(5509): 1783-1785

5 Lou D, Kohler H. Enhanced molecular mimicry of CEA using photoaffinity crosslinked C3d peptide.Nat Biotechnol1998; 16(5): 458-462

6 Dorman E, Bishai D. Demand for male contraception.Expert Rev Pharmacoecon Outcomes Res2012; 12(5): 605-613

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8 Zhou CX, Zhang YL, Xiao L,et al.An epididymisspecif c beta-defensin is important for the initiation of sperm maturation.Nat Cell Biol2004; 6(5): 458-464

9 Thornton BP, Vetvicka V, Ross GD. Function of C3 in a humoral response: iC3b/C3dg bound to an immune complex generated with natural antibody and a primary antigen promotes antigen uptake and the expression of costimulatory molecules by all B cells, but only stimulates immunoglobulin synthesis by antigen-specif c B cells.Clin Exp Immunol1996; 104(3): 531-537

10 Masilamani M, Kassahn D, Mikkat S,et al.B cell activation leads to shedding of complement receptor type II (CR2/ CD21).Eur J Immunol2003; 33(9): 2391-2397

（2014-07-15收稿）

Construction of eukaryotic recombinant plasmid pSG.SS.C3d3.YLBin1b and its expression in HEK293 cells*

Zhou Bo, Sun Zhongyi**, Jin Fengshuo, Li Yanfeng, Zhang Jun, Zhang Keqin
Department of Urology, Research Institute of Surgery, Daping Hospital, Third Military Medical University,
Chongqing 400042, China

Sun Zhongyi, sun200801@hotmail.com; Tel: 023-68757946

ObjectiveTo construct the eukaryotic recombinant plasmid pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b and detect its expression in HEK293 cells.MethodsThe cDNA fragment of gene Bin1b was f rst produced by PCR, then inserted into the eukaryotic plasmid pSG.SS.C3d3.YL to form recombinant plasmid pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b. After the recombinant plasmid was conf rmed by restriction enzymes digestion analysis and sequence, it was transfected into HEK293 cells to express the target protein Bin1b. The expression of Bin1b was detected by immunof uorescence, Western blot, immunohistochemistry staining, and flow cytometry assay, respectively.ResultsThe transfected recombinant vector pSG.SS.C3d3.YL-Bin1b expressed Bin1b protein in HEK293 cells.ConclusionThe successful expression of Bin1b in eukaryotic cells will establish a solid base for exploring the effect of high expression of Bin1b on the fertilization process.

eukaryotic cells; genetic vectors; gene expression; f uorescent antibody technique, indirect

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.09.001

R392

资助: 国家自然科学基金（81100546）; 重庆市自然科学基金（CSTC，2010BB5162）资助
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, E-mail: sun200801@hotmail.com; Tel: 023-68757946