人尿道狭窄组织的中成纤维细胞中相关因子在γ射线作用前后表达研究

屈卫星 李 晶 程永毅 徐永刚

陕西省人民医院泌尿外科（西安 710068）

人尿道狭窄组织的中成纤维细胞中相关因子在γ射线作用前后表达研究

屈卫星 李 晶 程永毅 徐永刚

陕西省人民医院泌尿外科（西安 710068）

目的研究人尿道狭窄组织中的成纤维细胞中iNOs、HSP47、MMP-1和MMP-2在放射线作用前后表达的变化。方法取材于人尿道狭窄段的新鲜瘢痕组织，并使用消化法与超速贴壁法分离出瘢痕成纤维细胞，在稳定传代5～6代后，给予5Gy单次铱192γ射线照射后，使用Western-blotting半定量分析照射前后iNOs，HSP47，MMP-1和MMP-2的表达情况。结果人尿道狭窄段的瘢痕成纤维细胞在接受固定安全剂量单次照射后，在24h时，iNOs与HSP47表达降低，MMP-1和MMP-2表达升高；在48h时，iNOs表达升高，HSP47持续表达降低，MMP-1和MMP-2持续表达升高。结论 取材于人尿道狭窄瘢痕中的成纤维细胞经放射线照射后的生物学指标iNOs处于调节上游，呈时相上的双向调节机制，处于下游的HSP47的表达受抑制，MMP-1和MMP-2表达受激活，可能在抑制成纤维细胞的增殖、减少胶原的稳定合成和促进细胞外堆积胶原的分解3个方面有效抑制瘢痕增生。

铱放射性同位素; γ射线; 尿道狭窄; 一氧化氮合酶; 基质金属蛋白酶类; HSP47热休克蛋白质类; 成纤维细胞

尿道狭窄术后预防复发一直以来都是令泌尿外科临床医生感到棘手的问题。Chiou等[1]利用超声图像，根据尿道狭窄的海绵体累及程度以及尿道狭窄的长度，把尿道狭窄分为5级：Ⅰ度：较短的狭窄（＜2.5cm）累及最小程度的海绵体组织。Ⅱ度：较短的狭窄伴有累及中等程度（有剩余部分海绵体组织环绕在病变尿道周围）的海绵体组织。Ⅲ度：较短的狭窄并累及大范围（全层）海绵体。Ⅳ度：较长（＞2.5cm）的狭窄或者合并伴有中等程度的海绵体组织累及。Ⅴ度：较长（＞2.5cm）的狭窄或者合并伴有大范围的海绵体累及。尿道狭窄的复发与局部的瘢痕细胞的形成和增殖密切相关，在瘢痕细胞的形成和增殖过程中，促进胶原合成与分解相关的成纤维细胞中的诱导型一氧化氮合酶（inductiblenitric oxide synthase, iNOs）和基质金属蛋白酶（matric metallo proteinases, MMPs）之间的动态平衡被打破，造成胶原过多堆积，热休克蛋白47（ Heat Shock Proteins-47，HSP-47）也参与了瘢痕形成过程中胶原蛋白的堆积[2]。已有研究证实γ射线能有效抑制瘢痕增生，并且已经应用于临床治疗瘢痕过度增生的疾病[3]。本文拟从细胞水平解释阐明γ射线抑制瘢痕细胞增生可能的过程及原理。

材料与方法

一、实验材料

男性尿道狭窄瘢痕段（Ⅰ度-Ⅲ度）切除术后标本（我中心提供）；β-actin抗体、Marker（美国），HSP47鼠抗（人）单克隆抗体、MMP-1鼠抗（人）单克隆抗体、MMP-2鼠抗（人）单克隆抗体、iNOs 鼠抗（人）单克隆抗体、羊抗鼠IgG二抗（北京博奥森）。铱192γ射线源（我院放疗科提供）。

二、实验方法

（一）男性尿道狭窄段组织成纤维细胞的分离

将组织块标本于含有抗生素的PBS液中反复冲洗数遍，去除多余的上皮组织；将组织小块分解5mm ×5mm大小的组织小块并适当向组织上滴加培养基使其保持湿润。送入离心管中，加入0.25%胰酶消化液-EDTA和胶原酶-Ⅰ，在37℃恒温水浴箱中消化4～5h，每1h振荡1次。滴加1滴细胞混悬液在载玻片上，倒置显微镜下可观察到有离散的细胞，并在红细胞计数器下计算细胞密度。将成纤维细胞混悬液匀速滴加在烧杯上滤网进行过滤，取滤过后的成纤维细胞混悬液170.2×g，离心5min；弃去上清液，加入6mL的新鲜培养液，充分吹打细胞，细胞培养箱中（37℃，5%CO2）培养。次日绝大部分成纤维细胞己贴壁，换细胞培养基，每隔2～3d给细胞换液1次。

（二）细胞的传代培养

观察细胞生长情况，待细胞生长成致密单层细胞密度约为70%～80%时，可传代培养，倒置显微镜下可观察到树突状及梭状成纤维细胞生长。

（三）细胞的冻存

在超净台中，将90%胎牛血清和10%的二甲基亚矾混合冻存液，4℃冰箱中保存。镜下观察细胞呈对数期生长，即铺满整个培养瓶底的70%，用0.25%胰酶消化液-EDTA消化，待瓶底细胞镜下漂浮起来，弃掉消化液，用冻存液吹打均匀，细胞悬液分装入预先消毒好的冻存管中，每管1mL；采用“慢冻速融”的原则，分别将冻存管置于4℃、-20℃、-80℃环境中各2h，然后置于液氮罐中。

（四）细胞的复苏

取出冷冻管，迅速放入37℃水浴中，并不时摇动，在1min内使其完全融化，然后在无菌下取出细胞。在169.2×g速度下离心10min，弃去上层液，加入适量培养液后接种于培养瓶中，接种浓度0.5×109/L，置37℃温箱静置培养，次日更换1次培养液，继续培养，观察生长情况。

（五）成纤维细胞不同时间段照射后继续观察培养

使用铱192γ射线单次5Gy剂量照射后24h，48h后继续观察培养。

（六）单层贴壁成纤维细胞总蛋白的提取与Western blot检测各组细胞中的相关因子的表达

单层贴壁成纤维细胞总蛋白的提取后SDS-PAGE电泳，终止电泳后进行转膜。然后免疫反应（使用杂交袋进行一抗和二抗的孵育），用化学发光，显影，定影。

结 果

使用Western blot检测各组细胞中的相关因子的表达，与未处理的尿道瘢痕细胞相比较，在经过单次使用5Gy的剂量放射线照射24h后，iNOs与HSP47表达量降低， 而MMP-1与 MMP-2表达量升高；48h后，iNOs表达量稍升高，HSP47表达量持续降低，MMP-1与 MMP-2表达量持续升高，见图1至图4。

图1 iNOs在细胞中的印迹表达

图2 HSP47在细胞中的印迹表达

图3 MMP-1在细胞中的印迹表达

图4 MMP-2在细胞中的印迹表达

讨 论

从本实验结果来看，在取材于人尿道瘢痕组织中的细胞水平上，放射线照射后在细胞信号通路上的效应是可以抑制瘢痕细胞增生的。

本研究所涉及可诱发瘢痕成纤维细胞过度增殖的正向调控细胞因子iNOS和HSP-47。其中以组织中iNOS产生的NO通过调节胶原蛋白的合成作用促进瘢痕疙瘩形成[4]。且在瘢痕疙瘩成纤维细胞中给予外源性NO通过cGMP方式刺激Ⅰ型胶原的表达以及转化生长因子β1的生成[5]，从而形成瘢痕组织。而HSP47是一种独特的胶原特异性分子伴侣[6]。HSP47在纤维化发病机制中有明确相关性。据研究表明，在肺，肾和肝的纤维化和瘢痕疙瘩中已发现了HSP47的表达增加。这些发现表明HSP-47参与了瘢痕疙瘩形成过程中胶原蛋白的堆积。

同样在瘢痕成纤维细胞过度增殖中扮演负向调控的相关因子是MMPs。MMP-1参与与肉芽组织和瘢痕形成密切相关的组织改建过程，MMP-1是蛋白质家族中最为特殊的一种酶，可以在单一位点分解Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型胶原的三股螺旋分子，使其解旋，之后酶被明胶酶继续降解，从而增加了纤维源性细胞生长因子的释放及活性作用；再者，细胞外过量沉积的胶原也可诱导MMP-1的大量表达[7,8]。MMP-2就是分解特殊的胶原蛋白-明胶。此酶可分解与胶原蛋白（明胶，胶原，层粘连蛋白）相连，C-端含有二型纤维粘连蛋白中3个重复部分，同时可分解Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型胶原分子[9,10]。从理论上讲，过量表达的MMPs可促使Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型胶原降解，抑制病理性瘢痕细胞的形成。

研究表明一氧化氮信号通路对瘢痕疙瘩形成的潜在影响，从病人身体中分离出来的瘢痕疙瘩成纤维细胞被用作一个模型系统。该报告对NO/cGMP信号通路对诱导瘢痕疙瘩成纤维细胞中的纤维化因子（TGF-β，TIMP-1和HSP47）的表达效果进行了观察，结果是正向调控，即I型胶原蛋白受到外源性一氧化氮的刺激，NO/cGMP信号通路中TGF-β的增加将激活SMAD信号级联反应，从而增加瘢痕疙瘩成纤维细胞中金属蛋白酶组织抑制因子（TIMP-1）和HSP-47的表达增加。

在放射线照射下24h后，在通路中，iNOs的表达的显著降低明显抑制与瘢痕修复相关的正向调节因子TGF-β与HSP47的生成。

此外，由iNOs生成NO还可调节基质金属蛋白酶的表达和活性[11,12]。使用大鼠肾小球系膜细胞作为研究对象的报告表明，NO在抑制胶原合成的同时，可能会增加基质金属蛋白酶的生成和活性[13,14]。数据表明，NO将增加细胞外基质金属蛋白酶-1的活性，分泌自AG皮肤成纤维细胞的蛋白水平与本研究结果一致。NO对胶原合成的抑制作用也可以通过其他机制进行调节。NO对兔子关节软骨细胞中的脯氨酰羟化酶（胶原蛋白经翻译后加工的一种重要酶）进行调节[15]。

综上所述，NO通过以下途径直接抑制胶原合成，这些途径包括脯氨酸羟基化，刺激MMPs，降低转化生长因子β（TGF-β）的生成[16,17]，启动成纤维细胞凋亡，和（或）中和蛋白纤维化活性氧物种。在放射线照射48h后，放射线作用的生物学途径中iNOs的表达再度上升和MMPs的持续高表达是在抑制瘢痕胶原堆积塑形中起到明显的作用。

我们能从动物模型的组织因子研究水平上和人离体尿道瘢痕细胞因子分泌在铱192γ射线照射后的变化存在一致性[18,19]，由此认为铱192γ射线对尿道瘢痕的生长有一定抑制作用。虽然已经有应用于临床的报道[20]，但其放射剂量的调控、效果的稳定性及远期的副作用尚待循证医学的进一步阐明。

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（2014-03-15收稿）

The expression of the related factors derived from f broblasts in the human’s urethral stricture tissue expose to γ radiation

Qu Weixing, Li Jing, Cheng Yongyi, Xu Yonggang
Department of Urology, Shaanxi Provincial People's Hospital, Xi'an 710068, Shaanxi, China

ObjectiveTo detect the expressions of iNOs, HSP47, MMP-1 and MMP-2 in f broblasts of urethral stricture tissue expose toγRadiation.MethodsFresh scar tissue of urethral stricture section was collected and the f broblasts were isolated using the digestion method and speeding adherence method.The isolated cells weresubcultured 5-6 generations and exposed to the radiation with the frequency of 5Gy/1 times. The expression of iNOs, HSP47, MMP-1 and MMP-2 before and after the radiation were measured by western blot.ResultsUnder the single radiation with f xed safety dose, scar f broblasts had lower expression of iNOs and HSP47, and higherexpression of MMP-1 and MMP-2 at the time of 24h; at the time of 48h, the treated cells had higher expression of iNOs, continuously lower expression of HSP47, and continuously higher expression of MMP-1 and MMP-2.ConclusionThe expression of- iNOs in f broblasts in exposure to radioactive rays presents the time-phase and two-way regulatory mechanism, and the expression of HSP47, at the downstream, is downregulated. The expressions of MMP-1 and MMP- 2 are upregulated, which may effectively inhibit the scar proliferation by inhibiting the proliferation of f broblasts, reducing the stable synthesis of collagen, and accelerating the decomposition of extracellular accumulation collagen.

iridium radioisotopes; gamma rays; urethral stricture; nitric oxide synthase; matrix metalloproteinases; HSP47 heat-shock proteins; f broblasts

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.09.005

R 339.57; R 695.4