体外受精受精率与男方精子参数的关系*

聂玉林廖宏庆,周 静,谢辉军彭翠英**

1. 南华大学药学与生命科学学院（衡阳 421001）;

2. 南华星辉生殖健康专科医院; 3. 南华大学附属第二医院

体外受精受精率与男方精子参数的关系*

聂玉林1,2廖宏庆2,3周 静2,3谢辉军1彭翠英1**

1. 南华大学药学与生命科学学院（衡阳 421001）;

2. 南华星辉生殖健康专科医院; 3. 南华大学附属第二医院

目的探讨体外受精（IVF）技术中精子处理前后常规参数与受精率的关系。方法 选择2011年6月到2013年3月在南华星辉生殖健康专科医院行IVF助孕的285个鲜胚周期，将这285个周期分为受精率≤40%组（A组）和受精率＞40%组（B组），分别比较两组处理前无A级精子比例、上游法回收率≤5%比例、处理后前向运动（PR）总数＜1.0×106比例、精子巴氏染色正常形态＜4%比例、精子顶体酶活性＜48.2μIU/106精子比例的差异。结果A、B两组处理前无A级精子比例（分别为14.7% 和0.4%，P＜0.05）、上游法回收率≤5%比例（分别为23.5%和0.8%，P＜0.05）、处理后PR总数＜1.0×106比例（分别为17.6%和0%，P＜0.05）均具有显著性差异（P＜0.05）；精子巴氏染色＜4%（分别为11.8%和10.0%）、顶体酶活性＜48.2 μIU /106精子（5.9%和2.4%）均无显著性差异。结论处理前无A级精子、上游法回收率≤5%和处理后PR总数＜1.0×106是影响受精率的高危因素；精子巴氏染色＜4%和精子顶体酶活性低对预测IVF受精率具有一定局限性。

受精,体外; 顶体蛋白酶; 精子计数

目前体外受精方式分为传统的常规体外受精（in vitrofertilization, IVF）和单精子卵细胞浆内注射法（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）。IVF技术主要适应于女性输卵管阻塞或损伤等原因造成的精子与卵细胞自然结合障碍，然而在目前的认识水平，IVF受精失败还无法完全避免[1]。ICSI技术主要用于严重少、弱、畸精子症以及梗阻性无精子症患者，由于该技术受精率稳定，大大地降低了受精失败的发生率，使得该项技术的应用范围逐渐扩大到包括临界精液质量、常规体外受精失败、不明原因不孕及非男性因素不孕等众多方面[1,2]。但是有学者统计，当精子功能无异常时，ICSI并不比传统IVF更有优势[3]，同时ICSI技术和IVF相比较减少了对精子的自然的筛选，增加了对卵子和精子的有创性操作，引入了不可测因素[1]，给出生小孩的健康问题带来担忧[4]。短时受精，早期补救ICSI的应用使得因受精失败而放弃移植的情况基本得到规避，同时也严格的控制了ICSI的指征[1]。但是补救ICSI增加了配子的操作次数和操作时间，而且早期受精状态的评估容易出现判断错误，导致3PN增加和未受精也未行补救ICSI[1]。对那些非严重少、弱、精症患者，该如何在授精术前选择合理的助孕方式，既能尽量采用创伤少的IVF授精方式，又能保证获得的卵子形成更多优质胚胎，一直是辅助生殖研究的重点。尽管一些精子功能学检测能够超越常规精液分析成为IVF成功的预测指标，但其在鉴别诊断方面的优势并不明显，还不足以与精液分析相结合成为常规操作[5]。本研究对我中心行IVF治疗的患者进行回顾性分析，探讨精子处理前后参数与低受精率的关系，从而预测精子受精能力。

对象与方法

一、研究对象

2011年6月至2013年3月，在南华星辉生殖健康专科医院行常规IVF助孕的285个周期，全部为促排卵周期，其中有9个周期行IVF+ICSI助孕，仅计算IVF部分的情况，所有周期均采用上游法处理精液。

二、主要试剂与耗材

精子培养液GIVF、人血清白蛋白HAS，购自瑞典Vitrolife公司；巴氏染色液（苏木素、橙黄G6，EA50）、顶体酶试剂盒购自深圳华康医学工程公司；15mL 锥形管2099和5ml 圆底管2003购自美国Falcon公司；1.5mL EP管（Eppendorf），购自德国艾本德公司。

三、实验方法

（一）分组

首先将周期按受精率分组（受精率 =IVF受精卵数/IVF卵数×100%），受精率≤30%组（受精率低下[6]），30%～组，40%～组，50%～组，60%～组，70%～组，80%～组，90%～组，根据鲜胚临床妊娠率（鲜胚临床妊娠率=鲜胚临床妊娠周期数/鲜胚移植周期数×100%）、无胚胎可移植率（无胚胎移植率=无可移植胚胎周期数/取卵周期数×100%）在40%上下具有统计学差异分为受精率≤40%组（A组，共34周期）和受精率＞40%组（B组，共251周期）。

（二）精子计数

精液检查和处理参照2010年WHO第五版《人类精液检查与处理实验室手册》[7]，操作人员均参加过WHO第五版的培训；精子分级采用WHO第四版《人类精液及精子与宫颈粘液相互作用实验室手册》[8]，A级精子即快速前向运动，在37℃时速度＞25μm/s；B级精子，慢速的前向运动，速度为＞5μm/s，≤25μm/s；C级精子，原地转圈，非前向运动，速度≤5μm/s，D级精子，完全不动。

（三）上游法处理精液

男方禁欲2～7d，取卵后1.5h安排患者排精，让排出的精液液化20min，将1.0～2.0ml精液置于装有2.0ml 90% GIVF（GIVF:HSA=9:1）的2099管底，45°倾斜在培养箱内加热模块中，培养箱温度为37.0℃，二氧化碳浓度为5%，上游40～50min，取上清液于另一管装5ml 90%GIVF的2099管中混匀，500×g，离心5min，弃上清液，留0.1～0.5ml混匀，将优选的精子混悬液转移至2003管中，置于培养箱中平衡用于授精。

（四）取卵与IVF授精

注射人绒毛膜促性腺激素（HCG,Human Chorionic Gonadotropin）后（35±0.5）h取卵，将在体视显微镜下找到的卵丘复合体装于2003管中，3～5个卵子/管，管中为90%的GIVF 1mL。拧松管盖放在二氧化碳浓度为6%，温度37.2℃恒定的培养箱中平衡。注射HCG后（39.5±0.5）h授精，先将1.0×105个精子加入装有1ml 90%GIVF的2003管中，将卵子转移至已加精子的2003管中，精卵混合（17±0.5）h后观察原核形成情况[9,10]，（65±1）h后观察胚胎情况[1,10]。

（五）精子巴氏染色

取精后30min计数，60min内根据精子浓度取0.1～0.5mL精液于1.5mL EP管中，用生理盐水清洗2遍，留0.5mL混匀制片，自然风干；根据WHO第五版《人类精液检查与处理实验室手册》标准染色，使用配制好的巴氏染色液，按照严格的形态学标准评估精子形态[7]。

（六）精子顶体酶活性

取精后30min计数，根据精子浓度取出精子分装于2个EP管，每管7.5×105个精子，一管为测试管，另一管为对照管。2000×g，离心20min，弃精浆，留沉淀，测试管与顶体酶试剂在24℃水浴箱中准确孵育60min，对照管加顶体酶试剂与终止反应液，2000 ×g，离心15min，取上清液在410nm波长下测吸光度值，顶体酶活性=（测试值-对照值）×105/（247.5× 7.5）μIU/106精子。

四、分析指标

上游法PR精子回收率[7]、处理后PR精子总数、无A级精子、精子巴氏染色、精子顶体酶活性，上游法回收率=（处理后体积×处理后浓度×处理后PR%）/（处理前体积×处理前浓度×处理前PR%）×100%；处理后PR总数=处理后体积×处理后浓度×PR% ；临床妊娠率=临床妊娠周期数/鲜胚移植周期数×100%；无胚胎移植率=无可移植胚胎人数/取卵周期数×100%

五、统计学分析

采用SPSS 13.0 统计软件进行统计学处理，对上游法PR精子回收率≤5%比例、处理后PR精子总数＜1.0×106比例、无A级精子比例、精子巴氏染色＜4%比例、精子顶体酶活性＜48.2μIU /106精子比例，进行x2检验统计分析，对例数≤5的组项进行Fisher's Exact Test分析，P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、不同受精率与临床妊娠率和无胚胎移植率的关系

由表1可见，受精率低下[6]组（≤30%组）17例，占IVF总周期的6.0%；A组（受精率≤40%）共34周期，占IVF总周期的11.9%，B组（受精率＞40%组）共251周期，占88.1%。各受精率组男、女方平均年龄无明显差异。鲜胚临床妊娠率A组16.7%（3/18）明显低于B组58.2%（107/184），差异有统计学意义（P＜0.05）；无胚胎可移植率A组29.4%（10/34）明显高于B组0.8%（2/251），差异也有统计学意义（P＜0.05）。

二、两组各项参数比较

A组与B组处理前后无A级精子比例、上游法回收率≤5%比例，PR总数＜1.0×106比例差异均有统计学（P＜0.05），巴氏染色＜4%比例和精子顶体酶低的比例差异无统计学意义（P＞0.05），见表2。

表1 各组受精率与妊娠情况表

表2 A、B两组常规参数比较

讨 论

辅助生殖技术经过20多年的发展，妊娠率在不断提高，精液检查也在不断改进，尤其是WHO第五版对精液检查和处理的质量控制（QC）和质量保证（QA）做了详细的讲解[7]，使得精液检查的精确性和准确性都得到提高。但是常规分析毕竟不能检测精子使卵子受精的潜能，也不能评估获得受精能力必需的成熟过程[11]。虽然一些精子功能学检测（如透明带穿透试验、精子DNA损伤检测、活性氧评估等）在预测精子受精潜能方面甚至超过常规精液分析，但是鉴于目前的检测方法还处于研究性阶段，可操作性不强或结果还存在争议[12]，因此对于一些处于临界状态的精子以及目前无法确定的功能异常精液，仍然影响着合理的助孕方式的选择。本中心通过回顾性的分析受精率低下与IVF处理前后的一些参数的关系，对精子受精能力做出一定的预测，从而为体外受精方式提供参考。

在受精率≤40%组中处理前无A级精子显著高于对照组，并且所有的无A级精子，其受精率均低于40%。这与Verheyen等[13]发现用没有或者很少A级活动精子的精液进行常规IVF受精失败的风险很高是相符的。Björndahil[14]认为精子活动力差可能有生殖道及生殖器官的某些疾病导致。精囊液中的精子活动力、存活率下降时同时伴有精子染色体保护水平下降，精子DNA碎片增加，有研究表明精子前向运动活动力与DNA碎片呈负相关，而精子DNA完整性破坏将导致精子受精能力显著下降[15]。精子尾部线粒体是精子的动力源，精子9+2微管是精子的动力臂，当精子线粒体活性不足或者功能障碍以及精子9+2微管存在缺陷，精子表现前向运动活力不足，而这些缺陷可能与某些基因突变有关，这种精子很可能造成IVF完全受精失败[16]。

由表2可见10周期上游法回收率≤5%的精子中有8周期出现受精率≤40%，但是仍有2周期受精率大于40%，原因可能是实验室进行IVF精液处理时，对精子浓度、活力都很好的精子并未追求最大回收率所致。上游法处理精子利用精子游动来筛选出活力良好的精子，操作简便，而且不会影响精子的生物学特征，有研究表明上游法处理后的精子较处理前正常形态精子比例增加，精子DNA碎片率降低[17]。由于精子必需克服重力来向上游，因此上游法PR精子回收率要低于密度梯度离心法。对于一些精液，当尽最大可能回收PR精子仍不能达到5%回收率，这种精子可能存在某种功能缺陷、快速前向运动精子比例不足或者患者精子对精子培养液中某些成分敏感，因此精子上游能力弱。

A组处理后PR精子总数＜1.0×106比例显著高于B组。虽然在ICSI发明前，当卵子充足的情况下，正常运动精子浓度＜1.0×106夫妇仍有47%的机会获得有胚胎，但是妊娠结局远低于对照组[18]。处理后PR精子总数与排出精液体积，精子浓度，活动力，存活率以及回收率相关。当患者排精充分，精液收集完全，尤其男方多年原发不育，精子存在功能异常的概率较大。有研究认为少、弱、畸精子症常常同时伴有精子功能缺陷。

由于样本量有限，虽然A组精子巴氏染色＜4%比例略高于B组，但并无显著差异，这与舒金春等通过精子形态来预测精子IVF受精能力具有局限性相符[18]。WHO第五版对于精子形态作了严格的标准，但精子形态正常并不一定意味着功能正常，精子正常形态率低不一定不能受精[18,19]而且WHO对精液参数的修订并未收集占据世界人口1/5的中国男性精子[18]。一些文献报道畸形精子对受精的影响，需要更加注重畸形的部位和畸形的程度[20]，尤其是一些遗传性决定的精子缺陷如圆头精子症、巨大头精子症、精子纤维鞘发育不良、原发性纤毛不动综合征等；而对于那些非遗传性精子形态异常（如锥形头、梨形头），经IVF受精仍能取得较好的结局[5]。同时上游法优选精子技术，能够回收出活动力强的精子，并且提高了正常形态精子的比例，有助于取得良好的受精及妊娠结局。

本研究对顶体酶活性＜48.2μIU/106精子的精液进行分析，A组高于B组，差异不具有统计学意义。WHO第五版对精子顶体酶活性检测，目前定为研究性检测，尚需要更大量的样本验证。精子顶体酶是由透明质酸酶、顶体蛋白酶、B-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶、酸性磷酸酶、芳基神经酰胺酶、胶原酶样多肽酶、磷脂酶等30多种酶组成的酶系[1,21]，而酶的反应具有高度专一性，顶体酶检查究竟是检查其中的哪一种或哪一类酶，目前的试剂盒并未标注，所以顶体酶活性高并不能代表精子顶体功能一定正常；同时顶体酶检查是针对750万个精子（包含活精子和死精子）的顶体酶总活性，并不能完全说明部分具有受精能力的精子的顶体功能。由于我们中心顶体酶活性低行IVF的样本数不够，其结论还有待进一步探讨。

综上所述，处理前无A级精子、上游法PR精子回收率≤5%和处理后PR精子总数＜1.0×106这3点是导致IVF受精率≤40%的高危因素，但是对于这种精子的存在哪些功能缺陷，还需要收集更多的样本，做进一步分析。对畸精子症还需要考虑畸形的部位和畸形的程度以及处理后的正常形态精子总数，顶体酶活性测定还需要更多样本以及方法学的验证，单独分析处理前畸精子症，以及目前试剂盒测定的顶体酶活性结果对预测IVF受精率具有一定局限性。

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21 郭睿. 男性生殖基础与实验室研究. 军事医学科学出版社, 2009; 71-72

（2013-12-12收稿）

The relationship between male sperm parameters and the fertilization rate of IVF*

Nie Yulin1,2, Liao Hongqing2,3, Zhou Jing2,3, Xie Huijun1, Peng Cuiying1**
1. Pharmaceutical and Life Sciences, University of South China, Hengyang 421001, China;
2. Nanhua Xinghui Reproductive Health Hospital; 3. The second aff liated hospital of South China university

Peng Cuiying, E-mail:pengcy0613@aliyun.com; Tel: 0734-8281224

ObjectiveTo study the relationship between the general parameters of sperm and the fertilization rate of IVF.MethodsA total of 285 IVF cycles were collected from Nanhua Xinghui Reproductive Health Hospital from June 2011 to March 2013. The 285 cycles were divided into group A (the fertilization rate of IVF ≤40%) andgroup B (the fertilization rate of IVF >40%). The percentage of without A grade sperm before preparation, the percentage of the recovery of sperm swim-up≤5%, the percentage of the total PR sperm after preparation <1.0×106, the percentage of normal sperm morphology of papanicolaous stain<4% and sperm acrosin activity<48.2MIU/106were analyzed respectively.ResultsBetween the two groups there were signif cant difference in the percentage of without A grade sperm before preparation (14.7% VS. 0.4%,P<0.05), the percentage of the recovery of sperm swim-up≤5%(23.5% VS.0.8%,P<0.05), the percentage of the total PR after preparation<1.0×106(17.6% VS.0%,P<0.05) , and there were not signif cant changes in the percentage of normal sperm morphology of papanicolaous stain<4% (11.8% VS.10.0%), the percentage of sperm acrosin activity <48.2 MIU/106(5.9% VS.2.4%).ConclusionWithout A grade sperm before preparation, the recovery of sperm swim-up≤5% and the total PR after preparation <1.0×106were signif cantly associated with the fertility rate of IVF. Whereas, sperm morphology of papanicolaous stain and sperm acrosin activity showed some limition in predicting the fertility rate of IVF.

fertilizationin vitro; acrosin; sperm count

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.03.007

R 321-33

*资金项目资助: 湖南省科技计划项目（2012FJ4296）; 国家自然科学基金（31371277）**

, E-mail:pengcy0613@aliyun.com; Tel: 0734-8281224