抗炎治疗对白细胞精液症患者精浆瘦素与活性氧的影响分析*

张 涛 陈 斌吕逸清 王鸿祥 胡 凯 金 炎

杨 昊 冯 坦 朱 宏 黄燕平 韩银发 王益鑫 黄翼然

上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿外科，上海市男科学研究所（上海 200001）

抗炎治疗对白细胞精液症患者精浆瘦素与活性氧的影响分析*

张 涛 陈 斌**吕逸清 王鸿祥 胡 凯 金 炎

杨 昊 冯 坦 朱 宏 黄燕平 韩银发 王益鑫 黄翼然

上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿外科，上海市男科学研究所（上海 200001）

目的探索抗炎治疗对白细胞精液症患者精子参数的改善情况及对精浆瘦素（Leptin）与活性氧（Reactive oxygen species, ROS）水平的影响，并分析其相关性。方法 随机选取2010年12月至2012年6月上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿男科门诊的白细胞精液症患者80例（WBC组），另选取各项参数均正常的40份精液标本作为对照组，在患者治疗前及经治疗精液白细胞水平恢复正常后，采用计算机辅助精液分析系统（CASA）行精液常规检测、放射免疫法检测精浆Leptin、TBA法检测精浆ROS。比较各参数的组间差异并分析其相关性。 结果WBC组治疗前精子浓度及活力均低于对照组（P＜0.05，P＜0.01），精浆Leptin与ROS水平高于对照组（P＜0.05，P＜0.01），精浆Leptin水平与精浆ROS水平具有正相关性（r=0.695，P＜0.05），经治疗后精子活力显著增加（P＜0.01），精浆Leptin及ROS水平亦明显下降（P＜0.05，P＜0.01）。结论白细胞精液症患者精浆Leptin、ROS水平均有增加，精子易受到氧化损伤导致其密度、活力下降，精浆Leptin与ROS水平之间存在正相关性，提示Leptin可能参与了氧化应激反应导致精子浓度和活力的下降。

白细胞精液症; 瘦素; 活性氧

白细胞精液症是指精液中白细胞数量超过1× 109个/L，通常由生殖系统感染引起，是导致精液质量下降和男性不育的重要病因之一[1]。白细胞可通过吞噬作用、产生活性氧（ROS）及分泌某些细胞因子等多种途径损伤精子的活力和功能，其产生ROS的能力比精子要强很多[2]。瘦素（Leptin）是一种主要由白色脂肪组织所产生的蛋白质类激素，主要负责调节机体的能量代谢，此外，其在青春期启动、血管生成、免疫功能和炎症反应等生理活动中也起着重要的调节作用。近年来，Leptin在生殖系统中的作用亦被发现并日益成为一个新的研究热点。不少研究表明Leptin在下丘脑、垂体前叶、睾丸及精子等与男性生育密切相关的器官、组织和细胞中广泛存在，对生精功能及精子凋亡等生理过程具有重要调节作用[3-6]。本研究通过比较白细胞精液症患者在抗炎治疗前后精子参数、精浆中Leptin和ROS的含量与正常组的差异，并分析其相关性，旨在对上述问题进行进一步探索。

材料与方法

一、研究对象

从2010年12月至2012年6月在上海交通大学医学院附属仁济医院泌尿男科门诊就诊的男性不育患者中随机选取白细胞精液症患者80例（均经过氧化物酶染色法明确诊断），作为WBC组；另选取各项检测参数均正常并使女方怀孕的40份精液标本作为对照组。

入选标准：（1）年龄为20～42岁男性。（2）性生活正常，未采取任何避孕措施2年以上未使女方怀孕，女方生育能力检查正常。（3）体检未发现明显睾丸、附睾及输精管异常。（4）无外伤及遗传性疾病家族史，无性功能障碍病史。（5）患者同意参加本次研究，依从性好。

排除标准：（1）恶性肿瘤患者正接受放疗、化疗者。（2）其他致男性不育因素，如成人双侧隐睾、精索静脉曲张、染色体异常等。（3）患有急性疾病、严重慢性疾病及家族性遗传病等。

二、实验方法

（一）精液标本收集

所有研究对象在留取精液前均禁欲2～7d，于本院取精室按标准步骤留取精液标本：排尿后洗净双手和阴茎，以手淫法将精液完整收集于专用的广口容器中。精液标本取出后立即放置于37℃水浴箱内，待精液充分液化后行精液常规分析。精液经3000×g，离心15min后分离出精浆、精子分别存于-80℃冰箱待统一检测。白细胞精液症组患者在精液中白细胞转阴后3个月分别再次按上述步骤留取标本，并同样处理保存。

（二）精液常规分析

精液标本经37℃水浴充分液化后，由专门检验人员按照《世界卫生组织人类精液及精子-宫颈黏液相互作用实验室检验手册（第四版）》标准，先在显微镜下目测分析，然后使用精液分析系统进行计算机辅助精液分析。每份标本检测均经两位检验员核校。

（三）TBA法检测精浆ROS

取各组离心分离后的精浆作为检测标本，采用南京建成生物工程研究所MDA试剂盒检测，按试剂盒说明书进行操作，在532nm处读取吸光度值，通过（测定管-测定空白管）/（标准管-标准空白管）计算得出精浆ROS值。

（四）放射免疫法检测精浆Leptin

选用北京福瑞生物工程公司Leptin放射免疫测定试剂盒，按试剂盒说明进行操作，用上海核所日环光电仪器有限公司全自动放射免疫γ计数器 读数，使用SN695B型γ放射免疫计数测量系统（第二版）绘制标准曲线并计算样品浓度。

结 果

一、对照组与WBC组患者基本信息

对照组年龄（27.69±6.53）岁，体质量指数（BMI）为（21.91±0.76）kg/m2；WBC组患者年龄（28.16±7.62）岁，BMI为（22.92±0.42）kg/m2，不育年限（3.26±1.67）年。对照组与WBC组在年龄、身高、体质、BMI方面均无统计学差异（P＞0.05）。

二、各组精液常规分析结果

由表1可见。各组精液pH无明显差别（P＞0.05）。WBC患者术前精子浓度、活力及活率均低于对照组，经治疗精液中白细胞恢复正常后精子浓度、活力及活率有上升，差异均有统计学意义。

表1 WBC组患者手术治疗前后与对照组精液常规检测结果比较

三、精浆Leptin与ROS检测结果

采用Mann-Whitney Test分析比较任意两组间差异。WBC组治疗前精浆Leptin水平高于治疗后及对照组，精浆ROS水平显著高于治疗后及对照组，差异均有统计学意义，见表2。

四、精浆Leptin与精浆ROS水平的相关性分析

采用Spearman等级相关法分析精浆Leptin与精浆ROS水平及精子凋亡之间的相关性，结果见图1，表3。

WBC组：精浆Leptin水平与ROS水平之间的相关系数为0.695，正相关性有统计学意义。

对照组：精浆Leptin水平与精浆ROS水平之间相关系数为0.087，无显著相关性。

表2 各组精浆Leptin与ROS检测结果

表3 精浆Leptin与ROS相关性分析统计结果

图1 对照组（左）与WBC组（右）精浆Leptin与ROS的相关性示意图

讨 论

白细胞精液症是导致男性不育的常见病因。精液中的白细胞是精浆中ROS 的主要来源，过量的白细胞可通过吞噬作用、产生大量ROS 等方式损害精子质量。ROS是需氧细胞在代谢过程中产生一系列活性氧簇，它们具有非常活跃的化学性质，主要包括超氧阴离子（O2-）、过氧化氢（H2O2）及羟自由基（•OH）等，它们中有的可作为第二信使，把细胞外刺激信号传递到核内，修饰蛋白使之磷酸化，引起级联反应，进而改变基因表达，上调如黏附分子和其他血管炎性分子的表达水平；另一方面，ROS可攻击精子细胞膜和线粒体内、外膜，使不饱和脂肪酸氧化，破坏脂质双分子结构，导致ATP生成减少，精子活力下降、死亡增加，并影响精子的顶体反应及受精功能[7-11]。不仅如此，ROS还能引起精子染色质异常和DNA损伤[12,13]。而上述损伤则有可能在细胞内启动凋亡程序，导致精子凋亡率的增加。

近年来多项研究表明局部Leptin水平升高与氧化应激、ROS水平升高有着密切的关系。 Leptin可以在多种组织细胞中引起氧化应激，有学者通过体外实验发现内皮细胞中高浓度的Leptin通过上调内皮素mRNA的表达而增加内皮素的合成，造成微环境平衡失调从而诱发氧化应激[14]。还有研究证实Leptin可以剂量依赖的方式增加人脐静脉内皮细胞ROS的产生，并激活JNK信号通路，增强活化蛋白1的DNA结合能力，从而增加单核细胞趋化蛋白1的表达[15]，并可诱导正常人单核细胞的呼吸爆发；在巨噬细胞中，Leptin能够增加脂蛋白脂酶的合成，氧化应激和蛋白激酶C参与了这一过程[16]。上述结果均说明氧化应激是Leptin作用的一个重要效应，本研究的结果证实白细胞精液症患者精浆Leptin水平与ROS水平密切相关。临床上一般通过抗感染、免疫抑制剂及手术治疗等方法来去除引起氧化应激的因素。我们的研究还发现，白细胞精液症患者经治疗白细胞恢复正常后，患者精浆Leptin与ROS均出现下调且精子质量出现了明显的改善。综合以上结果，我们认为，Leptin可能参与了氧化应激效应进而影响精子浓度、活力等参数。关于Leptin参与的氧化应激效应的具体机制，以及调节Leptin-氧化应激途径在辅助生殖中对提高受孕率、妊娠率及胚胎质量是否有所帮助，将是值得关注和进一步深入研究的课题。

1 Fariello RM, Del Giudice PT, Spaine DM,et al. Effect of leukocytospermia and processing by discontinuous density gradient on sperm nuclear DNA fragmentation and mitochondrial activity.J Assist Reprod Genet2009; 26(2-3): 151-157

2 吕逸清, 陈斌, 胡凯, 等. 不育症患者精子凋亡率与精浆活性氧水平检测及相关性分析. 上海交通大学学报•医学版 2009; 29(6): 705-708

3 Ahima RS, Saper CB, Flier JS,et al. Leptin regulation of neuroendocrine systems.Front Neuroendocrinol2000; 21(3): 263-307

4 Ishikawa T, Fujioka H, Ishimura T,et al. Expression of Leptin and Leptin receptor in the testis of fertile and infertile patients.Andrologia2007; 39 (1): 22-27

5 Soyupek S, Armagan A, Serel TA,et al. Leptin expression in the testicular tissue of fertile and infertile men.Arch Androl2005; 51(3): 239-246

6 Aquila S, Gentile M, Middea E,et al. Leptin secretion by human ejaculated spermatozoa.J Clin Endocrinol Metab2005; 90(8): 4753-4761

7 刘雅峰, 周灿权, 欧建平, 等. 精液白细胞对精液主要参数及精子功能的影响分析. 中国优生与遗传杂志2008; 16(2): 105-106

8 饶利强, 廖锦先, 叶向阳, 等. 精液白细胞与不育症之间的关系研究. 中国医药导报 2011; 8(35): 43-45

9 Osakh RA, Agarwal A, Kandlrall E,et a1. Leukocytospermia is associated with increased reactive oxygen species production by human spem.Fertil steril2002; 78(6): 1215-1224

10 高久春, 薛百功, 许宗革, 等. 精液白细胞与精子运动参数关系的研究. 中国妇幼保健 2005; 20(18): 2305-2307 11 岳林. 精液中白细胞含量与男性不育的相关性研究. 中国现代医学杂志 2006; 16(1): 102-104

12 Tremellen K, Tunc O. Macrophage activity in semen is significantly correlated with sperm quality in infertile men.Int J Androl2010; 33(6): 823-831

13 Erenpreiss J, Hlevicka S, Zalkalns J,et al. Effect of leukocytospermiaon sperm DNA integrity: a negative effect in abnormal semen samples.J Androl2002; 23(5): 717-723

14 Quehenberger P, Exner M, Sunder-Plassmann R,et al.Leptin induces endothelin-1 in endothelial cells in vitro.Circ Res2002; 90(6): 711-718

15 Bouloumie A, Marumo T, Lafontan M,et a1. Leptin induces oxidative stress in human endothelial cells.FASEB J1999; 13(10): 1231-1238

16 Maingrette F, Renier G. Leptin increases lipoprotein lipase secretion by macrophages: involvement of oxidativestress and protein kinase C.Diabetes2003; 52(8): 2l2l-2128

（2013-11-08收稿）

Analysis of the efffect of Anti-inflammatory therapy on seminal Leptin, ROS, in leukocytospermia patients*

Zhang Tao, Chen Bin**, Lv Yiqing, Wang Hongxiang, Hu Kai, Jin Yan,
Yang Hao, Feng Tan, Zhu Hong, Huang Yanping, Han Yingfa, Wang Yixin, Huang Yiran
Department of Urology, Ren Ji Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University; Shanghai Institute of Andrology, Shanghai 200001, China

Chen Bin, E-mail: dr_binchen@126.com

ObjectiveTo investigate the levels of seminal Leptin, ROS, as well as sperm parameters in leukocytospermia patients tretaed with anti-inf ammatory therapyand explore their correlation.MethodsTotal of 80 male infertility patients with leukocytospermia (WBC group) were enrolled in the study, and 40 normal sperm samples were taken as the control. The sperm parameters were detected by computer assisted sperm analysis (CASA). The levels of semen plasma Leptin and ROS were measured using RIA and TBA kits respectively.ResultsThe sperm concentration and viability in WBC group before treatment were lower than those of the control group (P<0.05,P<0.01), whereas, the levels of semen plasma Leptin and ROS were higher than those of the control group (P<0.05,P<0.01). The level of Leptin in semen plasma was positively correlated with the ROS level (r=0.695,P<0.05). After treatment, the increase of semen viability anddecrease of Leptin and ROS level were found in WBC group.ConclusionIncreased levels of seminal Leptin and ROS were founded in WBC group. Positive relationship between seminal Leptin and ROS indicated that Leptin might involve in oxidative stress and result in the decrease of sperm concentration and viability.

leukocytospermia; Leptin; reactive oxygen species

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.03.013

R 698.2

资助: 国家自然科学基金资助（课题编号：81270741）; 上海市浦东新区卫生系统重点学科群建设项目（PWZxkq2010-03）

**通讯作者, E-mail: dr_binchen@126.com