短时受精联合早期补救性卵胞质内单精子注射在重度畸形精子症患者中的临床应用

乜照燕吴海峰甄秀丽张 娜郭丽娜赵素英吕翠婷

1. 河北医科大学第四医院（石家庄 050011）；2. 河北省胸科医院

短时受精联合早期补救性卵胞质内单精子注射在重度畸形精子症患者中的临床应用

乜照燕1*吴海峰2甄秀丽1张 娜1郭丽娜1赵素英1吕翠婷1

1. 河北医科大学第四医院（石家庄 050011）；2. 河北省胸科医院

目的评估短时受精联合早期补救性卵胞浆内单精子注射（ICSI）术在重度畸形精子症患者中的临床应用。方法 235例重度畸形精子症患者（1%≤精子正常形态率＜5%）行体外受精-胚胎移植（IVF-ET）周期随机分组， 101例直接实施ICSI为A组，134例实施短时受精联合早期补救性ICSI为B组，短时受精后4～5h行极体观察，其中109例大于30%可见双极体列为B1组， 25例早期判断未见双极体或小于30%未见双极体行早期补救性ICSI术列为B2组。比较不同组受精率、卵裂率、优质胚胎率、胚胎种植率及临床结局。结果3 组的卵子成熟率分别为83.93%，87.03%和90.48%，正常受精率分别为78.76%，72.49%和75.61%，异常受精率分别为6.11%，14.88%和9.76%，卵裂率分别为83.93%，85.89%和84.96%，优质胚胎率分别为49.45%，50.49%和53.23%，胚胎植入率分别为28.10%，26.67%和32.00%，临床妊娠率分别为43.66%，43.04%和47.62%，流产率分别为6.45%，8.82%和10.00%。3 组的卵子成熟率、正常受精率、卵裂率、优质胚胎率、胚胎种植率、临床妊娠率、流产率差异均无统计学意义（P＞0.05），异常受精率在B1组有增高趋势，与其它组比较差异无统计学意义（P＞0.05）。结论短时受精联合早期补救性ICSI在重度畸形精子症患者有应用价值，可以最大限度的减少ICSI比率，获得好的临床结局。

精子/畸形; 卵胞浆内单精子注射, 男性不育; 受精

在不孕夫妇中，男方因素所占比例为40%左右。精液分析是评估男性生育能力的最客观和最直接的重要手段， 精子形态比精液其它参数更能体现男性生育价值， 在男性不育中约50% 存在精子形态异常。但目前有关精子形态的评定标准和它在体外受精中所起的作用一直存在争议。2010 年WHO出版了第五版《世界卫生组织人类精液检查与处理实验室手册》，新版手册修订最明显的内容之一是精子形态学的判读标准和正常参考值，将精子形态4%认为正常参考值[1]，这也引起巨大争议，精子形态是影响受精的重要因素之一[2,3]，一般认为正常形态精子＜15%体外受精能力下降。严重畸形精子症一直被认为是卵胞浆内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection, ICSI）的治疗指征[4]，然而一些临床实践表明ICSI并不是严重畸形精子症唯一最佳助孕方式[5,6]，严重畸形精子行ICSI需要重新审视，如何防范受精失败和严格控制ICSI 技术指征引起了生殖医学工作者的广泛关注。随着早补救ICSI的应用，为重度畸形精子症患者实施常规IVF提供了保证，本研究拟对重度畸形精子症患者采用短时受精结合早期补救性ICSI 技术，对重度畸形精子症患者授精方式进行评估。

对象与方法

一、研究对象

接受常规体外受精-胚胎移植（IVF-ET）治疗的235对重度畸形精子症（1%≤精子正常形态率＜5%）夫妇。极度畸形精子症患者即精子正常形态＜1%直接实施ICSI不在本研究范围，为排除女性不孕因素对卵子质量、受精、着床等的影响，以年龄＜35岁、基础卵泡生成素（FSH）水平≤10 mlU/mL、基础窦卵泡数≥10个为入组条件。排除标准为：多囊卵巢综合征、子宫内膜异位症或子宫畸形等。男方年龄23～37岁，女方年龄22～34岁。不孕年限l～10年。101例直接实施ICSI列为A组；134例实施短时受精联合早期补救性ICSI列为B组，短时受精后4～5h行极体观察，其中109例大于30%可见双极体列为B1组， 25例早期判断未见双极体或小于30%未见双极体行补救性ICSI术列为B2组。

二、研究方法

（一）精液常规检查

精液液化后按照《WHO人类精液及精子-宫颈黏液相互作用实验室检验手册》(第五版)要求行精液常规检查。

（二）精子形态学分析

采用Diff-Quick快速染色法染色，遵照新版手册的严格标准，只有带有尾部的可辨认精子才考虑进行精子计数，且所有形态处于临界状态的精子均列为异常， 每张涂片计数两次， 每次计数200条精子， 计算精子正常形态率。如两次计数的差值在可接受的范围内，则取两次计数的均值； 若两次计数的差值超出可接受的范围， 则重新涂片计数。

（三）控制性促排卵

采用长方案控制性超排卵，于排卵后第7天给予醋酸曲普瑞林0.1mg（商品名：达必佳，0.1mg/支，德国辉凌制药有限公司，注册证号：H20100365）皮下注射，第14天左右给予注射用重组人促卵泡激素 150-225IU（商品名：果纳芬，75IU/支，瑞士默克雪兰诺有限公司，注册证号：S20080030）启动促排卵，当主导卵泡中有1个直径达18 mm或2个达17 mm或3个达16mm，雌激素达到每个卵泡约200～300 pg/ mL，给予注射用重组人绒促性激250μg（商品名：艾泽，250μg /支，瑞士默克雪兰诺有限公司，注册证号：S20110045），36～37 h后取卵。

（四）短时受精

A组按以前标准直接行ICSI，取卵后卵子体外成熟培养3～4h 剥除卵周颗粒细胞后行ICSI，B组获取的卵细胞体外培养3～4 h 按4～5万精子/卵细胞的比例加入精子，卵细胞与精子共孵育4 h后，用拉细的巴氏吸管轻轻吹打卵丘复合物，除尽卵母细胞周围的卵丘细胞，置于新鲜培养液微滴中，观察第二极体出现情况，大于30%MⅡ见第二极体列为B1组，全部MⅡ卵子或小于30%MⅡ卵子未见第二极体则受精5h 后再次观察，仍未发现全部MⅡ卵子或小于30%MⅡ卵子未见第二极体立即行早期补救性ICSI列为B2组。

（五）受精观察胚胎评估及移植

受精及胚胎培养在恒温倒置镜下观察受精情况，以出现两原核作为正常受精标志。将正常受精的合子移入新鲜的培养液微滴中继续培养，并在授精后48h 及72h 观察胚胎发育情况。并评定胚胎质量。优质胚胎标准：第3天胚胎细胞数≥6个，碎片≤20%。

（六）胚胎移植与黄体支持

选择优质胚胎移植，移植胚胎数≤3 个，剩余Ⅱ级以上胚胎冷冻保存，并同时给予黄体支持。移植术后第14天测血β-hCG 阳性， 35d B 超观察宫腔内孕囊数和心管搏动确定临床妊娠。

（七）统计学分析

结 果

一、三组患者女方基本情况比较

三组患者在女方年龄、不孕年限、体重指数、基础FSH水平、基础窦卵泡数等方面的差异无显著性（P均＞0.05），见表1

表1 三组患者女方基本情况比较

表2 三组患者控制性超排卵情况比较

二、三组患者控制性超排卵情况比较

在控制性超排卵中，三组患者Gn天数、Gn用量、HCG日E2水平、HCG日子宫内膜厚度、平均获卵数均无统计学意义（P＞0.05），见表2

三、三组患者精液分析情况比较

三组精液量、精子密度、精子活动率、前向运动精子百分率、精子正常形态百分率均无显著性差异（P均＞0.05），见表3

表3 三组精液分析情况比较

四、三组畸形精子症患者体外受精结局的比较

三组患者受精率、卵裂率、优质胚胎率、植入率、妊娠率比较，差异无统计学意义（P均＞0.05）。B1组异常受精率有增高趋势，与其他两组比较差异无统计学意义（P均＞0.05），见表4

表4 三组畸形精子症患者体外受精结局的比较

讨 论

ICSI 是在体外显微镜下将单个精子直接注入成熟卵母细胞胞浆内，使精、卵结合的一种显微操作技术。该技术主要应用于男性因素不育， 成为男性严重少弱精子症、畸形精子症及阻塞性无精子症的有效治疗方法。Kruger等[7]首先提出严格的形态学标准分类用来评估精子质量，新版 WHO5 评估精子并用于指导辅助生育治疗对形态学的评估标准更为严格，形态正常精子百分率的参考值范围由WHO4 的15%下降到WHO5 的4%。精子形态是衡量精子质量的重要指标之一。常规IVF周期中，精子形态可影响受精率[8]，正常形态精子＜5%被认为是重度畸形精子症列入ICSI助孕指征，ICSI对精子的选择基于精子活力和大体形态，越过了自然选择过程，克服了精子形态缺陷导致的受精失败，使精、卵人为地“结合”到了一起，但可能会介入受损的父代基因[9,10]或导致印迹基因的损伤[11]，有研究证实ICSI有可能通过对雄原核H3K9双甲基化的影响进而影响胚胎生长发育[12]。ICSI 的介入性操作存在安全隐患，充分给予患者精卵自然结合的受孕机会，预防和避免重度畸形精子症受精失败成为改善某些IVF结局的重要环节，为此寻找受精的最早期证据非常重要。Chen等[13]加入精子后6 h 通过观察第二极体的释放确定受精与否，受精失败即行早期补救，获得了高妊娠率，短时受精结合补救ICSI，可成为预防受精失败的有效方法[14,15]。补救性ICSI的出现为尽早挽救可能受精失败的卵子提供了可能，同时又尽可能的避免了ICSI过度应用时人为选择精子的弊端。本研究评估了短时受精联合早期补救性ICSI在重度畸形精子症患者中的临床应用，结果如下。

夫妇双方的年龄， 不孕年限以及女方控制性超排卵情况可影响受精率、胚胎质量、妊娠结局。故本研究对入组病例的一般情况和控制性超排卵进行比较，三组的之间差异无统计学意义（P＞0. 05）。

本研究结果显示，实施早补救组25例，其中原发不孕16例，继发不孕9例，比较三组间受精率结果显示，正常受精率和异常受精率结果均无显著性差异（P＞0.05）， B1 组的异常受精率（14.88%）略高于B2组（9.76%）和A组（6.11%），进一步分析发现，短时受精的3PN 率明显升高，可能原因为短时受精过早去除卵丘细胞，使卵母细胞与周围的卵丘细胞及其分泌因子分离，脱离了卵丘细胞存在的微环境，使多精受精的发生增加；去除卵丘细胞机械刺激可能会损伤卵母细胞，增加多精入卵的机会；为达到改善畸形精子症患者受精率的目的增加精子受精浓度。

优质胚胎率方面，三组间结果均无显著性差异（P＞0. 05），体外受精中，胚胎质量更多地取决于卵母细胞的质量，卵龄对卵母细胞的质量有直接影响，随着卵母细胞在体外培养时间的延长，细胞浆和细胞核过度成熟，卵子质量退化，卵子老化程度加剧，从而影响受精及胚胎发育的潜能[16]。因此尽早发现受精失败并行补救非常重要。本研究的结果显示如果该患者的卵子不存在受精障碍，40%左右的卵子会在授精后4h排出第二极体， 80%的卵子会在授精后5h排出第二极体。在观察过程中，若极体边界不清晰，需轻轻拨动卵子，微调体视镜焦距，直至能清晰观察；若两个极体体积差别较小，只要边界清晰可见，优先考虑观察到的是第二极体；若两个可疑极体体积差别较大甚至数倍，则需要考虑是否是卵周间隙碎片样杂质；若极难判断是否是第二极体或极体破碎、形态异常需要延长观察时间、结合胞浆情况以及极体是否有位置变化来判断。早期受精的判断时机、判断依据以及早期失败补救标准的确立，将有助于该类患者胚胎结局的改善。

在临床结局的着床率、妊娠率、流产率三组间结果均无显著性差异（P＞0. 05），但有研究显示，早期补救ICSI 结局虽然优于晚时补救ICSI，但与常规IVF 相比有一定差距，表明卵母细胞最佳受精窗口可能比所估计的时间还要短或者有其他影响受精的原因，进而影响胚胎发育及妊娠结局[17]。本研究例数极少，未发现临床结局方面的差异，需扩大样本量，进一步研究。

总的来说，对于重度畸形精子症患者精子密度及活力达到常规IVF 要求，选择常规IVF 治疗是可行的，对于受精失败者，即刻行早期补救ICSI，也可获得满意的妊娠结局，既避免了ICSI 选择的扩大化、也避免了常规IVF-ET受精失败的担忧。重新审视严重畸形精子受精方式，充分给予患者精卵自然结合的受孕机会，严格控制异常形态精子行ICSI治疗指征，对避免异常遗传基因的传递、提高辅助生殖技术的安全性有积极的意义。

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（2013-10-25收稿）

Clinical application of short-period fertilization and early rescue intracytoplasmic sperm injection in the fertilization of severe teratozoospermia

Nie Zhaoyan1*, Wu Haifeng2, Zhen Xiuli1, Zhang Na1, Guo Lina1, Zhao SuYing1, Lv Cuiting1
1. The Fourth Affi liated Hospital of Hebei Medical University, Shijiazhuang, Hebei 050011, China; 2. Chest Hospital of Hebei Province Corresponding author: Nie Zhaoyan, E- mail: niezhaoyan@163.com

ObjectiveTo evaluate clinical application of short-period fertilization combined with early rescue intracytoplasmic sperm injection (ICSI) technique in fertilization of severe abnormal sperm.MethodsTotal 235 patients with severe teratozoospermia （1%≤Normal sperm morphology rate＜5%）for in vitro fertilization-embryo transfer (IVF-ET) cycles for egg were randomly divided into two groups. 101 cases of direct implementation of the ICSI as group A, 134 cases for short-period fertilization combined with early rescue ICSI as group B. Among group B, cumulus cells were removed after fertilization 4～5h, second polar body of oocytes was observed, in which 109 cases more than 30% visible bipolar body as B1 group, 25 cases of early judgment no less than 30% of bipolar body performed early remedial ICSI surgery as a group B2.The fertilization rate, cleavage rate, high-quality embryo rate, implantation rate and clinical outcome were comparatively analyzed among different groups.Results Egg maturation rates of three groups were 83.93%, 87.03% and 90.48% respectively, normal fertilization rates were 78.76%, 72.49% and 75.61%, abnormal fertilization rateswere 6.11%, 14.88% and 9.76%, cleavage rates were 83.93%, 85.89% and 84.96%, high-quality embryos were 49.45%, 50.49% and 53.23%, implantation rates were 28.10%, 26.67% and 32.00%, clinical pregnancy rates were 43.66%, 43.04% and 47.62%, miscarriage rates were 6.45%, 8.82% and 10.00%. there were no signifi cant difference in egg maturation rate, normal fertilization rate, cleavage rate , high-quality embryo rate, implantation rate, clinical pregnancy, miscarriage rates among three groups different (P>0.05). Abnormal fertilization rate in group B had an increasing trend, but the difference was not statistically signifi cant (P>0.05).Conclusion Short-period fertilization combined with early rescue Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) show great value for fertilization of patients with severe abnormal sperm. A good clinical outcome can be obtained if minimizing the ICSI.

spermatozoa/abnormalities; intracytoplasmic sperm injection, male infertility; fertilization

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.01.007

R 321-33

*通讯作者, E-mail: niezhaoyan@163.com