UPLC法测定人参流动浸膏中8种人参皂苷类成分*

李 薇，吉利娜，宋新波

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.天津中一制药有限公司，天津 300193）

UPLC法测定人参流动浸膏中8种人参皂苷类成分*

李 薇1，2，吉利娜1，宋新波1，2

（1.天津中医药大学，天津 300193；2.天津中一制药有限公司，天津 300193）

[目的]建立同时测定人参流动浸膏中8种人参皂苷类成分含量的超高效液相色谱法（UPLC）方法。[方法]采用Waters Acqutity UPLC色谱系统，Acqutity UPLC®BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×50 mm）色谱柱，流动相为乙腈-水，梯度洗脱，流速0.6 mL/min，柱温40℃，检测波长203 nm。[结果]人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3和Rd分别在0.009 7～0.291 0 μg，0.008 5～0.255 0 μg，0.0075～0.300 0 μg，0.010 4～0.416 0 μg，0.010 7～0.428 0 μg，0.007 4～0.296 0 μg, 0.004 2～0.168 0 μg和0.009 1～0.364 0 μg范围内成良好的线性关系，平均回收率分别为101.4%、101.1%、100.1%、99.8%、99.3%、98.8%、98.8%和100.5%。[结论]方法快速、准确、重复性好，可为人参流动浸膏的质量控制提供快速准确的检测方法。

人参流动浸膏；人参皂苷；UPLC；含量测定

人参为五加科人参（Panax ginseng C.A.Mey.）的干燥根，中医学认为人参是“补气第一要药”，《神农本草经》中归人参为上品，认为人参具有“主补五脏、安精定魄、止惊除邪、明目益智、久服延年”之功[1]。人参中主要有效成分是人参皂苷[2-3]。皂苷类成分的质量控制方法同常有紫外分光光度法、薄层扫描法、高效液相色谱法（HPLC）等[4]。2010版《中国药典》采用HPLC对人参药材中的3种成分进行测定[5]。人参流动浸膏是将6年生人参根进行提取、浓缩制成的人参制品，在韩国以及欧美都有很大的认可度。现在国际上较为认可的人参制品质量评价标准是将产中含量较高的8种人参皂苷类成分的含量相加。超高效液相色谱（UPLU）是近几年开始被广泛应用的一种技术，它的色谱柱塔板数和分离度高于HPLC，具有分析时间短，节约流动相的特点[6-7]。

本研究应用UPLC方法，建立了同时测定人参流动浸膏中人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd共8种成分的方法，具有较强的应用性。

1 仪器与试药

Waters Acqutity UPLC高效液相色谱仪，Acqutity H-class四元溶剂系统，FTN样品管理器，PDA检测器，Empower3色谱工作站（美国WATERS公司）。Milli-Q Advantage A10超纯水系统（美国Millipore公司）。KQ-250DE超声波清洗器（江苏省昆山市超声仪器有限公司，250 W，40 kHz）。AG-285型十万分之一天平（瑞士Mettler Toledo仪器有限公司）。标准品：人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb2、Rb3、Rd（批号分别为：201027、201123、200703、201122、200802、200501、201001，中国药品生物制品检定所）。人参皂苷Rc（批号：R-008-120628，成都瑞芬思生物科技有限公司，≥98%）。乙腈、甲醇（色谱纯，Thermo Fisher Scientific Inc.），超纯水。人参流动浸膏（批号：130520、130525、130610、130620、130625），提供单位：天津中一制药有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Acqutity UPLC®BEH C18（1.7 μm, 2.1 mm×50 mm）。流动相：乙腈（A）-水（B），线性梯度洗脱，0～3 min，19%A；3～3.8 min，19%～28%A；3.8～7.8 min，28%～32%A；7.8～11.8 min，32%～45%A；11.8～14 min，45%～502%A。流速0.6 mL/min，柱温40℃，检测波长203 nm。标准品和供试品UPLC图见图1。

2.2 溶液的制备

2.2.1 标准品溶液制备 精密称取标准品人参皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rc、Rb2、Rb3、Rd，加甲醇制成每1mL分别含上述成分0.097、0.085、0.075、0.104、0.107、0.074、0.042和0.091 mg的标准品混合溶液，备用。

图1 混合标准品溶液(A)及人参流动浸膏供试品溶液（B）的UPLC图Fig.1 UPLC chromatograms of reference substances(A) and Ginseng extract sample(B)

2.2.2 供试品溶液制备 精密称取供试品人参流动浸膏1.0 g，置具塞锥形瓶中，加入甲醇50 mL，称质量，超声（250 W，40 kHz）30 min，放置至室温，称定质量，加入甲醇，补足失质量，滤过。取续滤液10mL，蒸干，用甲醇溶解残渣并转移至2 mL量瓶中，加甲醇稀释至2 mL，滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2.3 线性与范围 精密吸取2.2.1项下的标准品溶液，分别取0.1、0.2、0.5、1、2、3、4 μL，注入超高效液相色谱仪，平行测定2次。分别以进样量（μg）为横坐标，8种样品峰面积积分值为纵坐标，计算得线性回归方程，数据见表1。

表1 人参8种皂苷的线性方程和范围Tab.1 Regression equations and ranges of eight ginsenosides

2.4 精密度实验 精密吸取2.2.1项下的标准品溶液，在2.1项下条件下连续进样6次，每次1 μL，测定8种人参皂苷的峰面积，其RSD分别为0.52%、0.89%、1.2%、0.64%、0.73%、1.0%、0.69%和0.88%，仪器精密度良好。

2.5 稳定性实验 按2.2.2项下方法制备同一批号的供试品溶液，分别于制备后第0、2、4、8、16、24 h测定，测定8种人参皂苷峰面积，其RSD分别为1.1%、1.4%、1.3%、1.2%、1.0%、1.6%、1.2%和1.4%，表明供试品溶液在制备后的24 h内的稳定性良好。

2.6 重复性实验 按供试品溶液制备方法平行制备同一批号的6份供试品溶液，按2.1项下色谱条件分析，计算人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rf、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3和人参皂苷Rd的含量分别为0.49、1.24、0.44、3.36、2.13、1.84、0.26和1.54 mg/μg，其RSD分别为1.6%、2.0%、2.2%、1.6%、2.4%、2.5%、3.2%和2.1%，表明该方法具有良好的重复性。

2.7 加样回收实验 精密称取已测得含量的人参流动浸膏样品0.5 g，按2.2.2项下方法，加入与含量等量的标准品制成样品含量与标准品量1∶1的6组供试品溶液，按2.1项下条件分析，计算加样回收率及RSD。测得人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1、人参皂苷Rc、人参皂苷Rb2、人参皂苷Rb3、人参皂苷Rd和人参皂苷Rg3的回收率为101.4%、101.1%、100.1%、99.8%、99.3%、98.8%、98.8%和100.5%，RSD为 1.7%、1.0%、1.9%、2.3%、2.2%、1.8%、1.0%和1.0%。

2.8 样品的测定 精密称取人参流动浸膏约0.1 g，按2.2.2项下方法制备供试品溶液，按2.1项下的色谱条件进样测定，计算人参流动浸膏中8种人参皂苷类成分的含量，结果见表2。

表2 人参流动浸膏中人参皂苷类成分的质量分数Tab.2 The contents of ginsenosides in Ginseng extract mg/g

3 讨论

本研究首次利用UPLC法对人参流动浸膏中的8种人参皂苷类成分进行同步测定。已有文献使用HPLC法测定人参药材中的8中人参皂苷的含量[8-10]，但是每个检测时间都在100 min以上，在实际应用过程中非常不便。本实验建立的UPLC方法，8个成分同时测定的测定时间在10 min之内，较HPLC法缩短了90%，而且节约溶剂，具有较好的应用价值。

本研究分别考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%甲酸水系统等不同的梯度洗脱系统。在乙腈-水系统下，8种人参皂苷类成分的分离度均大于1.5，且峰形较好。因此采用乙腈-水为本实验的流动相。比较了25、30和40℃等不同色谱柱温度下的分离效果，结果表明，40℃下柱压较低且分离效果最佳，因此确定的柱温为40℃。

有文献报道，对于测定时采用何种提取方法尚无定论[11-12]，常见的提取方法有超声提取和回流提取，本实验对两种提取方式进行了比较，发现两种提取方法提取效果相当，差异无统计学意义。超声提取相对于回流提取具有操作简便，速度快，节约能耗的优点，因此本实验采用超声提取的方法对人参流动浸膏进行提取。经过对不同提取溶媒、不同提取时间以及溶媒用量的提取效果的考察，最终确定以供试品料液比50倍量（g/mL）的甲醇作为提取溶媒，超声提取30 min作为本实验的提取方式。

综上所述，同时测定人参中8种人参皂苷的含量，不但可以更加准确的测定人参制品的中人参皂苷的含量，还可以通过8种皂苷之间的比例判断人参制品的原料来源[13-14]，因此具有很强的应用性。

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[5]中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典 (一部)[S].北京：中国医药科技出版社,2010:8.

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[8]魏 萍,黄旭腾.人参8种单体皂苷含量的同时测定[J].中国医院药学杂志,2009,29(22):1962-1963.

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[12]徐敬朴,孙从新,庄桂霞,等.RP-HPLC法同时测定人参提取物转化产物中20(S)、20(R)-人参皂苷Rg2和20(S)、20(R)-人参皂苷Rh1的含量[J].沈阳药科大学学报,2011,28(9):712-715.

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Determination of eight ginsenosides in Ginseng extract by UPLC

LI Wei1，2,JI Li-na1,SONG Xin-bo1，2
（1．Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China; 2.Tianjin Zhong Yi Pharmaceutical Co.,Ltd.,Tianjin 300193,China）

[Objective]To develop a ultra-high performance liquid chromatography method for simultaneously determination of eight ginsenosides in Ginseng extract.[Methods]The analysis was performed on a Waters Acqutity UPLC system eluted with mobile phases of acetonitrile and water in gradient mode.The column was Acqutity UPLC®BEH C18(1.7 μm,2.1 mm×50 mm).The flow rate was 0.6 mL/min. The column temperature was set at 40℃and the detection wavelength was set at 203 nm.[Results]Good linearity was obtained in the range of 0.009 7～0.291 0 μg,0.008 5～0.255 0 μg,0.007 5～0.300 0 μg,0.010 4～0.416 0 μg,0.010 7～0.428 0 μg,0.007 4～0.296 0 μg, 0.004 2～0.168 0 μg and 0.009 1～0.364 0 μg for ginsenoside Rg1，Re，Rf，Rb1，Rc，Rb2，Rb3 and Rd respectively.The method recoveries of eight compounds were 101.4%,101.1%,100.1%,99.8%,99.3%,98.8%,98.8%and 100.5%respectively.[Conclusion] The established method can rapidly receive an accurate and reproducible result used for controlling the quality of Ginseng extract.

Ginseng extract;ginsenoside;UPLC;assay

R284.1

A

1672-1519（2014）10-0624-03

2014-04-30）

（本文编辑：高 杉，于春泉）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.10.13

科技创新体系及条件平台建设计划项目（12TXG CCX03800）。

李 薇（1983-），女，硕士，研究实习员，主要从事天然药物制药工艺及质量控制方面的研究。

宋新波，E-mail:songxinbo@tjutcm.edu.cn。