黄芪甲苷对大鼠肝缺血/再灌注损伤的保护作用*

李铁成，马宝丰，李德生，艾丽丽，艾 浩

（辽宁医学院附属第三医院，锦州 121000）

·中药研究·

黄芪甲苷对大鼠肝缺血/再灌注损伤的保护作用*

李铁成，马宝丰，李德生，艾丽丽，艾 浩

（辽宁医学院附属第三医院，锦州 121000）

[目的]研究黄芪甲苷对肝缺血/再灌注损伤的保护作用及其机制。[方法]将雄性SD大鼠36只，随机分为3组：假手术组（Sham组）、肝缺血/再灌注组（I/R组）、黄芪甲苷预处理组（AsIV组）。分光光度法测定大鼠血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）活性；苏木精-伊红（HE）染色观察肝组织形态学变化，蛋白印迹法（Western blot）检测心肌组织内Bax,Bcl-2蛋白表达。[结果]与假手术组比较，肝I/R组ALT、AST活性显著增高，Bax蛋白表达增加，Bcl-2蛋白表达降低，黄芪甲苷预处理可以降低肝缺血/再灌注损伤引起的ALT、AST活性增高，Bax蛋白表达增加，增加Bcl-2蛋白表达。[结论]黄芪甲苷预处理对肝缺血/再灌注损伤有一定的保护作用，其机制可能与黄芪甲苷抑制肝细胞凋亡有关。

黄芪甲苷；肝缺血/再灌注损伤；细胞凋亡

肝缺血/再灌注损伤指各种原因导致肝脏血流中断或不足使肝脏缺血，当恢复血供再灌注后，肝细胞的功能代谢障碍及结构破坏反而加重。通过传统医学手段防治组织的缺血/再灌注损伤具有重要的临床意义。中药黄芪是豆科植物蒙古黄芪或荚膜黄芪的干燥根，味甘，性温，乃补气之圣药。黄芪甲苷是从黄芪中分离得到的一种具有多种药理活性的皂苷类化合物，其具有抗炎抗氧化、抗自由基、降血糖血脂、器官保护等广泛的药理作用[1-4]。研究发现，黄芪甲苷具有抗乙型肝炎病毒的潜力，保护肝脏免受病毒侵害[5]。在肝移植的大鼠模型中，黄芪甲苷的预处理可以通过降低肿瘤坏死因子-α（TNF－α），抑制核因子－κB（NF－κB）转录活性，进而减轻肝移植术后缺血/再灌注损伤的程度，提高术后存活率[6]。研究发现，细胞凋亡是肝缺血/再灌注损伤中重要的病理过程，黄芪甲苷是否可以通过抑制肝细胞凋亡进而发挥对缺血肝脏的保护作用，目前尚不清楚。本研究拟建立大鼠肝缺血/再灌注损伤模型，进一步探讨黄芪甲苷对肝脏的保护作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物 健康清洁级成年雄性SD大鼠36只，体质量（260±40）g，由辽宁医学院实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK（辽）2009-0004。

1.2 药品与试剂 黄芪甲苷，成都曼斯特生物科技有限公司。谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。Bax,Bcl-2一抗购自SANTA CRUZ公司。

1.3 分组及给药 36只SD大鼠随机分为：1）假手术组（Sham组）：只开腹不阻断血流。2）肝缺血/再灌注组（I/R组）。3）黄芪甲苷预处理组60mg/kg（AsIV组）。黄芪甲苷预处理组手术前5 d开始灌胃给药，每日1次。模型组和假手术组灌等体积的生理盐水。

1.4 实验方法

1.4.1 模型制备 大鼠手术前12 h禁食，自由饮水，仰卧位固定麻醉。上腹部正中切口，显露第一肝门，用小号无创伤血管夹钳夹肝蒂，阻断门静脉,肝动脉和胆总管，造成肝缺血，同时腹腔注射（ip）给予肝素每只200 U防治凝血，30 min后松开血管夹恢复肝血供，关闭腹腔分别在各时间点取血液和肝组织标本。

1.4.2 AST、ALT活性测定 分别于术前，再灌注2、4、6 h取血，按试剂说明书操作测定各组大鼠血清中AST、ALT含量。

1.4.3 肝组织形态学观察 再灌注6 h后，取缺血区肝组织于4%的多聚甲醛中固定12 h，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。石蜡横断面连续切片5～6片，厚度约5 μm，切片常规脱蜡脱水，常规苏木精-伊红（HE）染色，普通光学显微镜观察肝脏组织病理改变。

1.4.4 Bax、Bcl-2蛋白表达测定 再灌注6 h后，取缺血区肝组织置于-70℃冰箱备用。测定时取出样品，放入裂解液超声裂解组织，离心，取上清液，采用二喹啉甲酸法（BCA法）进行蛋白定量。然后每组取10 μL样品以及蛋白标准物点样，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，初始电压为90 V，观察Maker的移动情况，适时终止电泳。转膜、封闭、洗膜，切割后分别与其特定的稀释过的Bax,Bcl-2一抗4℃杂交过夜，然后用洗膜液洗膜3次，与二抗反应至少1 h，再次洗膜3次，加ECL显色，上机检测。

1.4.5 统计学处理 采用SPSS18.0统计软件分析结果，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较时，若方差齐采用LSD法，若方差不齐采用Dunnett’s T3法，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ALT、AST活性的测定 肝缺血/再灌注后肝功能指标AST、ALT持续增高，黄芪甲苷预处理可以在不同时间点不同程度的降低AST、ALT活性（P< 0.05），提示黄芪甲苷的预处理对肝缺血/再灌注的肝功能有一定的保护作用。见表1、表2。

表1 不同时间点ALT活性的变化（±s）Tab.1 The activity of ALT at different time points（±s）U/L

表1 不同时间点ALT活性的变化（±s）Tab.1 The activity of ALT at different time points（±s）U/L

注：与Sham组比较，*P<0.05；与I/R组比较，＃P<0.05。

组别 n Sham组 12 65±12 70±13 64±16 59±11 I/R组 12 68±18 367±32* 752±142* 1 087±121* AsIV组 12 78±17 98±15＃109±24＃128±29＃0 h 2 h 4 h 6 h

表2 不同时间点AST活性的变化（±s）Tab.2 The activity of AST at different time points（±s）U/L

表2 不同时间点AST活性的变化（±s）Tab.2 The activity of AST at different time points（±s）U/L

注：与Sham组比较，*P<0.05；与I/R组比较，＃P<0.05。

组别 n Sham组 12 50±12 63±14 47±11 64±10 I/R组 12 63±13 312±18* 789±56* 1 247±89* AsIV组 12 69±12 74±19＃132±34＃153±121＃0 h 2 h 4 h 6 h

2.2 肝组织形态学的变化 假手术组大鼠肝组织结构清晰，以中央经脉为中心肝细胞呈放射状排列，胞浆深染，汇管区无炎性细胞侵润。模型组肝组织中大量炎性细胞聚集浸润，以中央静脉为甚，肝窦变窄，肝索排列紊乱，可见肝细胞水肿及空泡样变性，偶见点状坏死。黄芪甲苷预处理可部分改善上述肝组织的形态学变化。

2.3 黄芪甲苷对Bax,Bcl-2蛋白的影响 见图2。示肝脏缺血/再灌注后抗凋亡基因Bcl-2表达降低、促凋亡基因Bax表达增加。而黄芪甲苷预处理可以部分逆转上述改变，提示黄芪甲苷预处理可以抑制肝缺血/再灌损伤中凋亡的发生。

图1 肝组织形态学变化Fig.1 The changes of liver pathological

图2 Bax、Bcl-2蛋白表达Fig.2 The protein expression of Bax,Bcl-2

3 讨论

肝缺血/再灌注损伤在临床上比较常见，如肝肿瘤切除、肝移植、休克等，是导致肝功能衰竭的重要原因，目前认为其发生机制可能与氧自由基爆发、微循环功能障碍、凋亡及炎症因子的激活等密切相关[7-9]。本实验通过建立大鼠肝缺血/再灌注模型，观察了黄芪甲苷预处理对肝缺血/再灌注损伤时肝细胞凋亡的影响，结果显示，黄芪甲苷预处理可以不同程度的降低缺血/再灌注后AST、ALT含量，抑制肝组织的形态学变化，提示黄芪甲苷预处理对肝缺血/再灌注损伤有一定的保护作用。

细胞凋亡是细胞死亡形式之一，近来发现细胞凋亡与肝缺血/再灌注损伤密切相关，采取有效的措施干预细胞凋亡，可减轻肝脏缺血/再灌注损伤。Bcl-2家族是细胞通过线粒体途径促进凋亡的重要调节因子，Bcl-2家族有两个重要的凋亡调控因子，即Bax和Bcl-2。Bax主要分布在线粒体外膜上，它的过表达可诱导细胞凋亡。而Bcl-2是抗凋亡因子，当Bax表达量高时，形成同源二聚体Bax/Bax，抑制Bcl-2的抗凋亡作用，而诱导细胞凋亡[10-12]。研究发现对肝缺血/再灌注损伤的保护作用可通过增加Bcl-2表达，抑制Bax表达实现。本实验通过电泳法探讨了黄芪甲苷对Bcl-2和Bax蛋白表达的影响，结果显示肝缺血/再灌注后Bcl-2表达降低，而Bax表达增加，与模型组相比黄芪甲苷预处理则可增加抗凋亡基因Bcl-2的表达，抑制促凋亡基因的表达，抑制凋亡信号的传导，发挥抗细胞凋亡的作用。

有报道黄芪甲苷的预处理可抑制炎症反应，抑制NF-κB通路的活化，预防小鼠肝脏缺血/再灌注损伤的发生[13]。黄芪甲苷大鼠常用剂量为20～80mg/kg[14]，本研究结合前期预实验结果探讨了60 mg/kg黄芪甲苷在整体动物水平上对肝缺血/再灌注损伤的保护作用，结果提示黄芪甲苷可能通过抑制肝细胞凋亡，进而发挥对肝缺血/再灌注损伤的保护作用，这一结论为中药黄芪的开发提供了实验依据。

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Protective effect of Astragaloside IV against liver ischemia and reperfusion injury in rats

LI Tie-cheng,MA Bao-feng,LI De-sheng,AI Li-li,AI Hao
（The Third Affiliated Hospital of Liaoning Medical University,Jinzhou 121000,China）

[Objective]To investigate the protective effect of Astragaloside IV (As IV)against liver ischemia and reperfusion injury and the underlying mechanism.[Methods]The 36 SD rats were randomly divided into 3 groups:sham operation group (Sham group),liver ischemia-reperfusion (I/R group)group and As IV group.The content of ALT and AST were measured by spectrophotometric method. Liver pathological changes were observed by HE staining.Bax and Bcl-2 protein expression was determined by Western blot.[Results] Compared with sham group,the content of ALT and AST was significantly increased,while the Bcl-2 protein expression decreased and the Bax expression increased.Pretreatment of As IV before liver I/R could decrease the content of ALT and AST,Bax expression,and increase the Bcl-2 protein expression(P＜0.05).[Conclusion]As IV pretreatment has a protective effect against liver ischemia reperfusion injury,which is partially finished via inhibiting liver cell apoptosis.

Astragaloside IV;liver ischemia reperfusion injury;cell apoptosis

R285.5

A

1672-1519（2014）10-0621-03

2014-05-15）

（本文编辑：高 杉，于春泉）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.10.12

国家自然科学基金资助项目（81173443）；辽宁省教育厅资助科研资助项目（LJQ2011087）。

李铁成（1970－），男，博士，副主任医师，主要研究方向为围术期器官保护。