涤痰散结活血软坚中药对非酒精性脂肪肝大鼠血清白介素-6、超氧化物歧化酶表达的影响

王 静，王绪霖，杨 强

（1.天津中医药大学第一附属医院消化科，天津 300193；2.天津医科大学总医院消化科，天津 300052）

·实验研究·

涤痰散结活血软坚中药对非酒精性脂肪肝大鼠血清白介素-6、超氧化物歧化酶表达的影响

王 静1，王绪霖2，杨 强1

（1.天津中医药大学第一附属医院消化科，天津 300193；2.天津医科大学总医院消化科，天津 300052）

[目的]通过观察涤痰散结活血软坚中药对非酒精性脂肪肝大鼠血清白介素-6（IL-6）、超氧化物歧化酶（SOD）表达的影响，探讨复方中药的作用机制。[方法]雄性SPF级Wistar大鼠60只，按体质量分层随机分为4组：正常对照组14只，自由饮水和普通饲料饮食。模型对照组18只，中药高剂量组14只，中药低剂量组14只，均予自由饮水和高脂饲料饮食，8周后随机处死模型对照组大鼠4只，确定脂肪肝模型成立。造模成功后，分别对中药低剂量组和高剂量组行中药灌胃，模型对照组、正常对照组以生理盐水灌胃，每周称大鼠体质量，治疗8周后处死，采用ELISA法检测血清IL-6、SOD。[结果]大鼠血清IL-6比较：高剂量组、低剂量组与模型对照组比较差异有显著性（P＜0.01），高剂量组与低剂量组比较，差异有显著性（P＜0.05）。大鼠血清SOD比较：高剂量组与模型对照组比较，差异有显著性（P＜0.01），低剂量组与模型对照组比较差异有显著性（P＜0.05），高剂量组与低剂量组比较无统计学意义（P＞0.05）。[结论]涤痰散结活血软坚中药可以显著减低血清IL-6浓度，此作用表现出剂量相关性趋势，可以明显升高血清SOD浓度，此作用没有体现出剂量相关性趋势。

非酒精性脂肪肝；涤痰散结活血软坚法；白介素-6；超氧化物歧化酶

非酒精性脂肪性肝病（NAFLD）是肝细胞内大量甘油三酯聚集而引起的临床病理综合征，肝的组织学改变与酒精性肝病（ALD）相似，但无过量饮酒史。NAFLD包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎（NASH）、NASH相关肝纤维化和肝硬化。其发病机制尚不完全清楚，可能是遗传环境、代谢应激等所致，常与肥胖、高脂血症、胰岛素抵抗（IR）等代谢综合征相关[1-2]。近年来研究发现脂肪细胞分泌的脂肪因子对诱导和加重IR有重要作用。本研究采用高脂饮食建立脂肪肝大鼠模型，观察涤痰散结活血软坚中药对大鼠血清白介素-6（IL-6）、超氧化物歧化酶（SOD）表达的影响，进一步探讨复方中药的作用机制。

1 材料

1.1 实验动物 Wistar大鼠60只，雄性，体质量为（188±10）g，由北京军事科学院提供，饲养于天津中医药大学第一附属医院实验动物中心，室温18～24℃，明暗各12 h清洁级动物实验室。

1.2 主要试剂和药物 胆固醇：纳瑞增（天津）生物科技有限公司。IL-6试剂盒：天津嘉格生物科技有限公司。SOD试剂盒：天津嘉格生物科技有限公司。涤痰散结活血软坚法药物组成：丹参20 g，金钱草30 g，生牡蛎20 g，海藻15 g，草决明20 g，虎杖15 g，何首乌20 g，夏枯草15 g，由天津医大总医院中药房代煎。

2 方法

2.1 模型制备与分组 在动物房内适应性喂养1周后，按体质量分层随机分为4组，包括正常对照组14只、模型组18只、中药高剂量组14只、中药低剂量组14只。

正常对照组饲以普通饲料，其余3组均饲以高脂饲料，实验动物自由进食和饮水。高脂饲料：84%基础饲料，4%蛋黄粉，10%猪油，2%胆固醇。

2.2 标本制备 8周后随机处死模型对照组大鼠4只，确定脂肪肝模型成立。造模成功后，分别对低剂量组和高剂量组以每日生药1.28 g/100 g和每日生药2.56 g/100 g行中药灌胃，模型对照组、正常对照组以生理盐水灌胃，每周称大鼠体质量，治疗8周后处死，取血待测。

2.3 血清IL-6、SOD的测定 均采用ELISA法，严格按试剂盒说明书流程检测。

3 统计方法

采用SPSS19.0软件进行统计分析，计量资料采用均数±标准差（±s）表示。多组间比较计量资料采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD法，P<0.05为差异有统计学意义。

4 结果

4.1 一般情况 实验中，高脂饮食大鼠较正常组体质量增加迅速，且模型组大鼠反应灵敏性下降，不喜动。灌胃开始，第1周由于操作手法不熟练，高剂量组和低剂量组各5只大鼠、模型对照组4只大鼠因药液呛肺死亡。实验过程中，除8周时处死4只模型对照组大鼠、取血前处死2只正常对照组大鼠练习操作，共死亡14只，剩余大鼠共40只。

4.2 大鼠血清IL-6的测定结果 模型对照组升高，与正常对照组比较差异有显著性（P＜0.01），高剂量组、低剂量组降低，与模型对照组比较均差异有显著性（P＜0.01），高剂量组与低剂量组比较差异有显著性（P＜0.05），表明高低剂量的复方中药在降低血清IL-6浓度水平方面效果肯定，且效果与药物剂量有相关性，见表1。

表1 大鼠血清IL-6浓度变化（±s）Tab.1 Change of serum IL-6 in rats（±s）ng/L

表1 大鼠血清IL-6浓度变化（±s）Tab.1 Change of serum IL-6 in rats（±s）ng/L

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，##P＜0.01。

组别 n IL-6浓度正常对照组 12 87.63±10.25模型对照组 10 114.77±12.40**低剂量组 9 100.64±7.90##高剂量组 9 89.93±12.60##

4.3 大鼠血清SOD的测定结果 模型对照组降低，与正常对照组比较差异有显著性（P＜0.01），高剂量组升高，与模型对照组比较差异有显著性（P＜0.01），低剂量组升高，与模型对照组比较差异有显著性（P＜0.05），高剂量组与低剂量组比较差异无统计学意义（P＞0.05），表明高低剂量的复方中药均可以确切的升高血清SOD活性水平，见表2。

表2 大鼠血清SOD活性水平变化（±s）Tab.2 Change of serum SOD in rats（±s）U/L

表2 大鼠血清SOD活性水平变化（±s）Tab.2 Change of serum SOD in rats（±s）U/L

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01。

组别 n SOD活性正常对照组 12 92.12±15.91模型对照组 10 68.95±13.07**低剂量组 9 84.56±14.79#高剂量组 9 90.30±16.22##

5 讨论

近年来，由于生活方式、饮食结构的改变，中国脂肪肝发病率有上升趋势[3]。

NAFLD根据症状、体征可归为中医学的“胁痛”、“肥气”、“肝着”、“痰浊”、“积聚”等范畴[4-5]。本病的病位主要在肝，涉及脾、胃、胆、肾等多个脏腑。脾失健运，水谷精微运化失常，痰湿内生，蕴而为病。肾中精气不足，导致蒸腾气化失司，津液内停，停聚成为痰湿。肾阳亏虚，影响及脾，脾阳亦虚，健运无力，亦可生成湿痰，此即所谓“脾主湿，湿停则为痰。肾主水，水泛亦为痰”。此外肝失疏泄，气机郁滞，横逆犯脾，亦可致脾失运化，水谷精微（可包括脂肪等）不归正化，形成痰湿脂浊内生。痰湿内停闭阻于肝经，肝气郁滞，气滞则血行不畅，又可形成瘀血，痰浊瘀血相互交结遂成本病。

天津中医药大学阮士怡教授从医70余年，从事老年病尤其致力于心血管疾病的研究，早年他提出“益肾健脾，涤痰软坚散结”法治疗疾病。受阮士怡教授学术思想的指导和启发，天津医科大学总医院消化科王绪霖主任将阮士怡教授的治法应用于消化系统疾病脂肪肝、肝纤维化、自身免疫性肝病、以及慢性胃炎、溃疡性结肠炎等疾病的治疗中得到可喜的疗效。

本方中重用丹参、生牡蛎为君药，以涤痰祛瘀、活血软坚，丹参还能养肝血，化死血，生新血；夏枯草、海藻为臣药，助君药加强活血涤痰，软坚散结功效，又能清泄肝热；草决明、虎杖、金钱草为佐使药，既助祛湿化痰，又可利水通便，使浊邪有出路；何首乌养阴血、补肝肾[6]。诸药配伍共奏祛痰化瘀，清热利湿，软坚散结之功效，又配伍养血之首乌，使清利而不伤阴，活血而不耗血，全方用药痰瘀同治，邪毒从二便而解，使气机畅、痰湿化、瘀血去，腑气通，从而恢复肝胆的正常功能。

现代药理学研究发现：丹参有降低血脂、保护肝脏的作用。夏枯草有降脂、保肝和抗氧化的作用，夏枯草多糖对自由基及亚硝酸根离子具有一定的清除能力，具有防止膜脂质过氧化、降低脂质过氧化产物丙二醛的生成、改善血液流变学部分指标的作用[7-8]。海藻中的非饱和脂肪酸能降低血清及肝脏中胆固醇的含量。草决明能显著抑制肝损伤时机体内脂质过氧化反应，提高血清以及肝脏组织内超氧化物歧化酶抗氧化活性，降低脂质过氧化产物丙二醛的含量，进而调节肝病变时体内的氧化应激反应[9]，达到保护肝脏的目的。虎杖煎剂能明显对抗四氯化碳（CCl4）引起的大鼠肝损伤，显著降低血清天门冬氨酸转氨酶（AST）、丙氨酸转氨酶（ALT）含量[10]，还可促进损伤肝组织的微循环，抑制白细胞、血小板与肝脏内皮细胞的黏附，促进肝细胞再生修复的能力，其有效成分白藜芦醇可明显拮抗二甲基亚硝胺诱导的大鼠肝纤维化[11]，并能减少细胞氧自由基（ROS）生成，降低细胞死亡率。何首乌对多种高脂动物模型都有明显降脂作用。

IL-6是一种由T细胞、内皮细胞、脂肪细胞分泌的细胞因子，是经典的炎症因子，同时也是具有广泛免疫调节作用的脂肪因子，正常人脂肪组织可分泌IL-6。Wieckowska等发现NASH患者其肝脏IL-6的表达要远高于单纯性脂肪肝患者及正常人，认为IL-6可能与NASH的发展有密切联系。

近年来随着饮食结构和生活方式的改变，由高脂饮食和饮酒所致混合性脂肪肝及脂肪性肝炎呈上升趋势[12]。高脂饮食所诱发的极低密度脂蛋白（VLDL）、甘油三酯（TG）和游离脂肪酸（FFA）含量增高，以及伴随的高密度脂蛋白水平下降和肠源性内毒素血症，使肝脏Kupffer细胞聚集、增生、激活并分泌肿瘤坏死因子-α（TNF-α）、白介素-1（IL-1）、IL-6等细胞因子[13-15]，导致生物膜的损伤。

IL-6可通过抑制脂蛋白酯酶的活性，阻抑脂肪分解，增加脂肪储存，从而使循环中TG水平升高，进而促进脂肪肝的形成。近年来研究表明，肥胖症患者的血清IL-6水平升高，低能量饮食能显著降低脂肪组织和外周血中的IL-6水平[16]。IL-6与瘦素有相同的信号传导通路，都须经过转录激活子（STAT）家族中的STAT1、STAT3才能发挥效应，因此IL-6可能与瘦素竞争STAT结合位点，导致瘦素不能发挥作用，形成瘦素抵抗，造成高胰岛素血症、IR综合征，从而参与脂肪肝的发病[17]。IL-6作为刺激因子还可直接刺激肝细胞、储脂细胞及库普弗（Kupffer）细胞增生分泌胶原、层黏蛋白和蛋白多糖，参与肝纤维化的形成[18]。临床上抑制IL-6的活性可能是防止肝纤维化的有效途径和手段。

超氧化物歧化酶（SOD）是广泛存在于需氧代谢细胞中一种重要的ROS清除剂，是体内重要的抗氧化物质，此酶能催化氧自由基歧化反应，清除超氧离子自由基，进而避免当体内超氧阴离子自由基浓度过高时引起细胞损伤的不良反应[19-21]。过量自由基可与生物膜中多价不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应，产生大量脂质过氧化物（LPO），破坏生物膜的正常结构和功能，造成肝组织细胞损伤。SOD反映了肝细胞抗氧化能力，在机体氧化和抗氧化平衡中有着至关重要的作用。目前人们通常检测SOD的活力可以评价机体的抗氧化损伤的能力。

涤痰散结活血软坚中药可以显著减低血清IL-6浓度，减轻炎性反应，减少其诱导的细胞凋亡和胰岛素抵抗，保护肝细胞，且此作用表现出剂量相关性趋势，可以明显升高血清SOD活性，可以减少不稳定的超氧化离子等的产生，减轻肝细胞氧化应激反应，但此作用没有体现出剂量相关性趋势，其确切的作用机制尚有待进一步的研究。

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Effects on the traditional Chinese medicine of Ditan Sanjie,Huoxue Ruanjian on the expression of IL-6, SOD in rats with nonalcoholic fatty liver disease

WANG Jing1,WANG Xu-lin2,YANG Qiang1
（1.Digestion Department,The First Affiliated Hospital of Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China; 2.Digestion Department,General Hospital of Tianjin Medical University,Tianjin 300052,China）

[Objective]To establish a model of fatty liver induced by fat-rich diet in rats，observe the effect of the traditional Chinese medicine of Ditan Sanjie(clearing away phlegm and dispersing the accumulation),Huoxue Ruanjian(activating blood circulation and softening the hard mass)on the expression of IL-6,SOD and discuss the mechanism of Ditan Sanjie,Huoxue Ruanjian method. [Methods]Sixty male Wistar rats(SPF level)were randomly divided into 4 groups according to the weight:control group(n=14),fed normal diet;model group(n=18),fed fat-rich diet;traditional Chinese medicine high-dose group(n=14),fed fat-rich diet;traditional Chinese medicine low-dose group(n=14),fed fat-rich diet.Four of model control group were randomly killed 8 weeks later.Low-dose group and high-dose group were fed with Chinese herbs for 8 weeks.Model group and control group were fed with isotonic Na chloride.All of the rats were weighted every week,8 weeks after treatment and all of the rats were killed.The serum levels of IL-6 and SOD were detected by ELISA method.[Results]The serum levels of IL-6 in rat of high-dose group and low-dose group showed highly significant difference compared with model group(P<0.01).The comparison between high-dose group and low-dose group showed significant difference(P<0.05). The serum levels of SOD in rats showed highly significant difference between high-dose group and model group (P<0.01)and showed significant difference between low-dose group and model group(P<0.05).The comparison of serum SOD showed no statistically significance between high-dose group and low-dose group (P>0.05).[Conclusion]Tthe traditional Chinese medicine of Ditan Sanjie, Huoxue Ruanjian can significantly decrease the serum levels of IL-6,and significantly increase the serum concentrations of SOD. However,this effect does not show any dose-related trend.

nonalcoholic fatty liver disease;Ditan Sanjie,Huoxue Ruanjian method;interleukin-6;superoxide dismutase

R285.5

A

1672-1519（2014）10-0613-04

2014-04-22）

（本文编辑：马 英，高 杉）

10.11656/j.issn.1672-1519.2014.10.10

王 静（1978-），女，博士，副主任医师，研究方向为中西医结合治疗消化系统疾病。