蛋白质组学在大肠癌证候本质研究中的应用现状

2014-04-15柴仲秋

吉林中医药 2014年6期

柴仲秋，刘维，周冰

(1．天津中医药大学，天津300193;2．天津市滨海新区塘沽中医医院，天津300450;3．天津中医药大学第一附属医院，天津300193)

大肠癌是世界范围内常见恶性肿瘤，发病率及病死率居第3位［1］，具有高复发和远处转移的生物学特性。随着综合治疗方案研究的日益深入，整体观念指导下的中医辨证论治逐渐成为大肠癌治疗方案中不可忽视的一环，其积极作用也日益显现。然而中医辨证繁杂、模糊、难以掌握也成为制约大肠癌中医治疗进一步发展的瓶颈。因此，运用现代研究方法揭示大肠癌证候本质成为近年来研究的热点。

系统生物学方法的运用［2］以及证候相关的生物学标志研究不断涌现［3］。而后基因组时代的到来为证候本质的研究提供了新的研究思路和技术平台。蛋白质组学是对不同时间和空间发挥功能的特定蛋白质群体进行研究，能够从整体水平反应疾病过程中蛋白质表达的动态演变过程，与中医辨证论治的认识论和方法论具有极大的相似性。目前已有应用蛋白质组学技术初步探讨冠心病［4-6］、肝纤维化［7］、类风湿关节炎［8］以及子宫内膜异位症［9］等疾病的中医证候本质的报道。该项技术日益广泛的应用也为大肠癌中医证候本质的研究提供了新思路和新方法。课题组成员为了总结和分析蛋白质组学在大肠癌中医证候本质研究中的应用情况，对相关文献进行了系统检索和梳理。

1 文献检索策略及方法

设立1974年01月至2013年11月为检索时间段。选择“肠癌/肠肿瘤”“蛋白质组学”“证候”“中医客观化”“辨证”为关键词制定检索策略，检索中国生物医学文献数据库(CBM)、中文生物医学期刊目次数据库(CMCC)、中文科技期刊数据库(生物医药信息版)、中国知网(CNKI)及万方数据等中文数据库。以“colorectal cancer”OR“colon cancer”OR“rectal cancer”OR“colorectal carcinoma”OR“colon carcinoma”OR“rectal carcinoma”OR“colorectal tumor”OR“colon tumor”OR“rectal tumor”OR“colorectal neoplasm”OR“colon neoplasm”OR“rectal neoplasm”“proteomics”“Chinese medicine”“syndrome differentiation”为关键词制定检索策略，检索PubMed、荷兰医学文摘(EMbase)等英文数据库，结合计算机初筛及人工手检共筛选出密切相关文献5篇。

2 蛋白质组学在大肠癌中医证候本质研究中的应用报道

周小军等［10-12］应用双向凝胶电泳分离大肠癌组织蛋白质，通过银染，PDQuest 2-DE软件分析，筛选差异蛋白质点并进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析，测定胶内酶解后的肽质指纹图谱，通过查询SWISS-PROT、NCBI数据库鉴定差异蛋白质。运用这一方法其先后比较了湿热蕴结证、气血亏虚证大肠癌患者肿瘤组织之间的差异蛋白质，以及2组患者与正常人结肠黏膜组织的差异蛋白质。结果显示:3组之间的差异表达蛋白主要集中在热休克蛋白(HSP)、细胞骨架蛋白、抗氧化蛋白、信号转导相关蛋白、能量产生相关蛋白、血液蛋白等。

赵海燕等［13］应用双向凝胶电泳分离大肠癌姑息治疗期血瘀组、气血亏虚组及健康组人群的血清蛋白，然后经不同波长光激发扫描得到不同样品的蛋白质组图谱，经DeCyder Image QuantTMV 6.5软件分析，选择血瘀组与健康组和气血亏虚组相差达1.15倍以上的蛋白进行质谱鉴定。结果最终确定了10个差异蛋白质。其中血瘀组较健康组和气血亏虚组蛋白质表达量均上调的4个:IL-8、维生素D结合蛋白前体、β-GDP解离抑制因子、α-二酯酰甘油激酶;均下调的1个为纤维结合蛋白(FN);有3个较健康组上调而较气血亏虚组下调:肿瘤基因DJ-1、载脂蛋白A-I前体、软骨关联性蛋白前体;有2个较健康组下调、而较气血亏虚组上调:ADP核糖基化类蛋白15、血清淀粉样蛋白A。

3 讨论

“证”是疾病发展过程中某一阶段的病理概括，从中西医结合医学的角度，中医证候本质是指引起证发生发展的物质基础，这些物质决定着证的动态变化过程。蛋白质是人体功能表现的物质载体，通过蛋白质组学分析证之间的差异蛋白，为中医证候本质研究提供了一条新的途径。

将蛋白质组学应用于大肠癌证候本质的研究中，其结果初步反应了部分症状的物质基础，为证候的外在表现与内在本质建立了沟通的桥梁，但仍然存在一些问题需要进一步探讨。

3.1 证候辨识的客观与规范由于疾病本身以及中医诊断的复杂性，目前尚未有全国公认的大肠癌证型诊断标准。近年来有关大肠癌证候研究的文献中应用的参考标准包括《中医病症诊断疗效标准》《中医病证分类与代码》《中医临床诊疗术语·证候部分》《中药新药临床研究指导原则(试行)》《中华中医药学会标准:中医肛肠科常见病诊疗指南》以及《中华中医药学会标准:肿瘤中医诊疗指南》等。此外，还有以症状调查为基础，通过频数分析［14］、因子分析及聚类分析［15］等统计方法探索大肠癌辨证分型的报道，这些方法均是对证候客观辨识的有益尝试，但受到样本量及证候调查客观化的限制仍难以广泛推广。

3.2 蛋白质组学技术的改进蛋白质组学作为一个生物工程，其研究非常艰巨。但随着蛋白质组学技术的建立，使同时分离数千种蛋白质的技术成为现实，减少了由于样本成分复杂而造成的干扰或个体差异，提高了样本的均一性和复杂性，又保持了多样品、多蛋白的同时分析，从而把每个蛋白放在一个具有相互参照的背景里。可见，蛋白质组学技术的不断发展，将为证本质的研究提供技术支持。目前已发表的应用蛋白质组学研究大肠癌证候本质的报道中主要应用双向凝胶电泳(2-DE)技术和生物质谱(MS)分析技术。洪朝金等［16］认为表面增强激光解析电离-飞行-质谱(SELDI-TOF-MS)蛋白质芯片技术较传统的二维凝胶电泳相比，具有样品需要量少，可发现多种方式的组合蛋白质谱，可直接用粗样本进行检测，获得的图谱单一、重复性好，可以分析二维凝胶电泳无法分析的蛋白质，包括疏水、跨膜等电点及低分子量蛋白质等优点，更有利于大肠癌证候的本质研究。此外，同位素标记技术目前已开始在其他疾病的蛋白质组学研究中广泛应用。覃慧婵等［17］应用iTRAQ联合LC-MS/MS技术筛选了肺腺癌的血浆生物标志物。基于同位素标记的蛋白质定量技术比非同位素标记定量的准确性更高，同时联用液相色谱分离技术，在蛋白质疏水性、相对分子质量和等电点方面的局限小，能够有效补充非标定量和胶分离技术的缺点。因此，不断关注蛋白质组学技术的改进，有利于更高效准确的寻找大肠癌证候间的差异蛋白，进而为研究证候本质提供更多的参考和依据。

3.3 数据的验证及挖掘蛋白质组学技术的应用将大肠癌证候本质的研究带入了前所未有的大数据时代。目前的文献报道中，主要应用质谱技术结合相应的软件及数据库对差异蛋白进行鉴定以及功能检索。然而，单纯对差异蛋白的鉴定还不能满足证候本质研究的需要。如何对蛋白质组学实验结果中大量的差异蛋白进行验证，以及如何以此为基础，进一步深入探讨差异蛋白及其所在通路在大肠癌证候形成中的作用机制，都将是下一阶段应用蛋白质组学研究大肠癌证候本质的核心任务。

［1］Siegel，R．Cancer statistics，2013［J］．CA Cancer J Clin，2013，63(1):11-30．

［2］吴小秋，刘志龙．中医证候的系统生物学研究［J］．吉林中医药，2013，33(1):12-14．

［3］郭炜，韩涛，董文亮，等．冠心病心绞痛及其中医证型的生物学标志研究［J］．吉林中医药，2011，31(10):1030-1032．

［4］朱明丹，杜武勋，姜民，等．冠心病不同证候的蛋白质组学研究［J］．辽宁中医杂志，2013，40(7):22-27．

［5］王刚，姜民，朱明丹，等．冠心病心血瘀阻证和心肾阴虚证的蛋白组学研究［J］．辽宁中医杂志，2011，38(3):26-28．

［6］袁宏伟，杜武勋，朱明丹，等．冠心病心气虚弱证/心肾阴虚证血清蛋白质组学特征研究［J］．时珍国医国药，2012，23(4):238-240．

［7］唐春梅，魏嵋．蛋白组学在肝纤维化及中医证候研究中的运用［J］．湖南中医杂志，2013，29(3):123-124．

［8］孙志岭，王玲，王富强，等．类风湿关节炎湿热痹阻证血清比较蛋白组学分析［J］．时珍国医国药，2013，24(1):237-239．

［9］黄金燕，魏绍斌，文怡，等．运用蛋白质组学研究子宫内膜异位症中医证候的探讨［J］．时珍国医国药，2012，23(1):210-212．

［10］周小军，周福生，孔梅，等．大肠癌虚实证候与蛋白质差异性表达的研究［J］．中华中医药杂志，2011，26(8):1808-1811．

［11］周小军，周怀力，苟新敏，等．大肠癌湿热蕴结证患者蛋白质差异性表达的研究［J］．中华肿瘤防治杂志，2010，17(22):1831-1834．

［12］周小军，周福生，苟新敏，等．大肠癌气血亏虚证患者蛋白质差异性表达的研究［J］．中国中西医结合急救杂志，2010，17(5):274-277．