原因不明自然流产中芳香烃受体与Treg／Th17细胞因子平衡的关系

郭红玲，徐风娟，茅彩萍，庄燕燕，夏飞

（1．太仓市第一人民医院妇科，江苏太仓215400；2．苏州大学附属第一医院生殖医学中心，江苏苏州215006）

原因不明自然流产中芳香烃受体与Treg／Th17细胞因子平衡的关系

郭红玲1，徐风娟1，茅彩萍2，庄燕燕2，夏飞2

（1．太仓市第一人民医院妇科，江苏太仓215400；2．苏州大学附属第一医院生殖医学中心，江苏苏州215006）

目的：检测芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）在原因不明自然流产患者蜕膜组织中的表达，探讨其表达与蜕膜中调节性T细胞（T regulatory cell，Treg）／Th17细胞因子平衡之间的关系。方法：选择原因不明复发性流产患者23例作为观察组，另选择正常早孕妇女30例作为对照组；采用实时荧光定量PCR法检测两组蜕膜组织中AhR、叉头样转录因子p3（forkhead box p3，Foxp3）、IL-10及维甲酸孤独核受体γ（retinoic acid receptor-related orphan receptorsγ，ROR-γ）等mRNA表达，并对AhRmRNA表达与Foxp3、IL-10、ROR-γmRNA表达作相关分析。结果：观察组蜕膜中AhRmRNA、ROR-γmRNA表达明显高于对照组，但Foxp3 mRNA、IL-10 mRNA则明显低于对照组（P均＜0．05）。两组蜕膜中AhRmRNA表达与ROR-γmRNA表达呈正相关（P均＜0．05），与Foxp3 mRNA以及IL-10 mRNA表达则无明显相关性（P均＞0．05）。结论：原因不明自然流产患者蜕膜中AhRmRNA及Th17细胞因子表达均升高，而Treg细胞因子表达下降，Treg／Th17细胞比例下降。AhR表达增高与Th17细胞因子上调相关。

自然流产；芳香烃受体；调节性T细胞；Th17

自然流产病因复杂，机制尚不明确。现代免疫学观点认为，正常妊娠的维持依赖于母体对胎儿建立的局部免疫耐受环境，对父方来源的胎儿组织发生免疫识别和产生免疫反应。母方来源的免疫细胞、胎儿来源的绒毛膜外滋养细胞和其他间质细胞汇集于母胎界面［1］，这些细胞通过表达表面分子建立母胎之间的信息传递网络，从而形成耐受妊娠的免疫微环境，有利于正常妊娠的维持。

调节性T细胞（T regulatory cell，Treg）是调控母胎界面局部免疫耐受形成的重要因素，对正常免疫耐受和妊娠的维持起重要作用。Treg为CD4＋CD25＋T细胞，具有免疫负性调节功能，其分泌的细胞因子主要有IL-10、TGF-β等。叉头样转录因子p3（forkhead box p3，Foxp3）为Treg细胞标记分子，反映其活性水平［2］。研究发现［3］，在小鼠孕早期转移体外扩增的Treg能够保护胚胎避免自然流产。Th17细胞是一类以高分泌IL-17为特征的CD4＋T细胞，维甲酸孤独核受体γ（retinoic acid receptor-related orphan receptorsγ，ROR-γ）为其特异性调节因子。研究发现［4］，复发性流产患者外周血Th17细胞明显增多。

许多研究发现，母胎界面Treg／Th17平衡失调是引起原因不明自然流产的重要原因。有报道称［5］，与健康妊娠者相比，复发性流产患者外周血中CD4＋CD25brightFoxp3＋Treg细胞减少，Th17细胞增加，Th17／Treg比率明显增高。Lee等［4］研究也发现，复发性流产非妊娠女性中IL-17＋T细胞（包括Th17和Tc17细胞）明显高于对照组，而Foxp3＋，Foxp3low和CD4＋Foxp3＋T细胞明显降低。

芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）是一种配体激活转录因子，以配体依赖的方式调节Treg／Th17的平衡［6］。AhR高亲和力配体主要为环境毒素四氯二苯对二噁英（2，3，7，8-etrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）以及内源性色氨酸衍生物6-甲酰基吲哚并咔唑（6-formylindolo［3，2－b］carbazole，FICZ）。当前者激活初始T细胞中AhR时，T细胞向Treg分化；而当后者激活AhR时，初始T细胞则向Th17分化。AhR在病理妊娠过程中是否发挥作用尚缺乏研究，因此，本研究将分别检测AhR在原因不明复发性流产患者和正常早孕者蜕膜组织中的表达情况，并分析其与蜕膜中Treg／Th17细胞因子平衡的相关性，从而初步探讨其在复发性流产中的作用。

1 对象与方法

1．1 研究对象

选择2013年1月至9月就诊于我院妇产科门诊及妇科病房，＜35岁的原因不明自然流产患者23例，作为观察组。其中，16例发生过1次自然流产，7例发生过2次自然流产。入选标准：男方精液分析正常；月经周期正常，通过妇科检查、白带检查以及超声检查等排除器质性疾病、生殖器官畸形及感染性因素；夫妇双方无家族遗传病及近亲结婚史；无自身免疫性疾病；自身抗体检查：抗核抗体系列、抗卵巢总抗体、抗子宫内膜总抗体，抗心磷脂抗体、抗精子总抗体、抗双链DNA、抗中性粒细胞质抗体均为阴性；以往未进行过相关免疫治疗；无内分泌代谢紊乱性疾病；凝血系列、全血分析均正常。

另选择同时期在我院妇产科门诊手术室行人流术的健康早孕妇女30例，作为对照组。入选标准：＜35岁，妊娠12周以内要求人工流产的健康妊娠妇女；本次妊娠期间无先兆流产症状和体征；超声证实胚胎发育正常；既往无解剖异常、遗传性疾病、内分泌疾病史，无自然流产、死胎、死产史，无生殖道感染，无自身免疫性疾病史。

两组年龄与孕周间差异均无统计学意义（P＞0．05）。本研究经本院伦理委员会批准，受试者均知情同意。

1．2 方法

1．2．1 标本收集 无菌操作条件下分别收集两组蜕膜组织，PBS漂洗后剪取约100 mg，置于DEPC处理过的EP管中，加入1 mL Trizol试剂，于－80℃保存备用。

1．2．2 实时荧光定量PCR法检测mRNA表达 取出“1．2．1”中的组织，待溶解后，用组织匀浆仪粉碎，Trizol法提取总RNA；Nanodrop 2000分光光度计测定RNA浓度，加入DEPC调节各样本RNA浓度为500μg／μL备用。用TaKaRa公司反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA，于－20℃保存备用。用SYBR Green法进行实时荧光定量PCR。按照Bestar Real-time PCR Master Mix（DBIBioscience，USA）说明书配制反应体系，置入ABIViia7（Applied Biosystems，USA）PCR仪中反应。PCR反应条件：95℃预变性2 min，然后95℃15 s，60℃31 s，共40个循环。每个样本设3个复孔。用单克隆大肠埃希菌分别稀释100、1 000、10 000、100 000倍后作为模板配置上述体系后行PCR，用所得Ct值制作标准曲线Y＝a Ct＋b，计算a、b值，分别将各样本所测Ct值带入标准曲线计算出相应Y值，依据Y值计算相对表达量（△t）：△t＝Y（检测基因）－Y（GAPDH），检测基因mRNA的相对表达量为2－△t。引物由上海英潍捷基贸易有限公司合成。引物序列见表1。

1．3 统计学方法

采用SPSS 17．0软件进行统计学分析。资料符合正态性分布，采用两独立样本t检验，P＜0．05为差异有统计学意义。采用Pearson相关性分析，相关系数r＞0．5时为相关性良好。

2 结果

2．1 两组蜕膜中各因子mRNA的表达

观察组蜕膜中AhR、ROR-γmRNA表达明显高于对照组，而Foxp3、IL-10 mRNA表达明显低于对照组（P均＜0．05）。见表2。

2．2 两组蜕膜中各因子表达量的相关性比较

观察组和对照组蜕膜中AhR mRNA表达与ROR-γmRNA表达均呈正相关（P均＜0．05），而与Foxp3 mRNA以及IL-10 mRNA表达均无明显相关性（P均＞0．05）。见图1。

3 讨论

AhR又称二噁英受体，体内表达水平较低［7－8］，但分布较为广泛，在肺、肝、肾、胎盘、扁桃体等组织及B淋巴细胞中均有表达。AhR通过介导多环芳烃类的毒性作用，参与某些重要的生物学过程［7，9－10］。AhR与不同配体结合后影响细胞的不同功能，并进一步影响Treg／Th17平衡［11－12］，从而调节机体的免疫状态。

AhR表达于母胎界面、孕早期胚胎、蜕膜组织和孕前子宫内膜［13］，正常足月分娩胎盘的合体滋养层细胞内也有表达。本研究结果显示，观察组蜕膜组织中AhR表达明显高于对照组，提示AhR高表达可能与原因不明自然流产之间存在联系。AhR配体可在生殖道和胚胎中聚集，从而增强局部AhR的表达，进而参与各种生理病理过程。本研究中AhR在原因不明自然流产蜕膜组织中表达增高，致使部分具有胚胎毒性的AhR配体发挥更强的作用，影响蜕膜的免疫平衡及胚胎发育，导致病理妊娠。

本研究结果还显示，观察组患者蜕膜中Treg因子Foxp3、IL-10的表达明显低于对照组，而Th17细胞因子ROR-γ的表达明显高于对照组。不同T细胞中AhR表达也不同［14－15］，Treg中AhR表达远低于Th17细胞。因此，本文观察组AhR表达增高可能是由于Th17细胞表达增加所致。此外，本研究结果显示，AhR表达与ROR-γ表达呈良好的正相关，由此表明，检测AhR表达水平可间接反映Th17水平，从而评估胚胎存活可能；同时，可通过改变AhR水平治疗部分免疫因素的自然流产。但是，AhR与Treg的细胞因子Foxp3和IL-10无明显相关性，可能由于Treg中AhR表达过低，由此可见，AhR难以用于反应Treg的表达水平。因此，推测AhR可能参与Th17的表达上调，干扰Treg／Th17平衡，进而在母胎面免疫调节中起作用，并影响妊娠结局。复发流产患者AhR表达增加是导致Th17上调的原因，还是Th17表达增加后的一个协同表现，目前尚有待进一步研究。

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Relationship between aryl hydrocarbon receptor and the balance of Treg／Th17 cytokines in unexplained spontaneous abortion

GUO Hong-ling1，XU Fen-juan1，MAO Cai-ping2，ZHUANG Yan-yan2，XIA Fei2
（1．DepartmentofGynaecology，the First People′s Hospital of TaiCang，Taicang Jiangsu 215400；2．Departmentof Reproductive Medicine，the First Affiliated Hospital of Suzhou University，Suzhou Jiangsu 215006，China）

Objective：To investigate the expression of aryl hydrocarbon receptor（AhR）in decidua of unexplained spontaneous abortion，and explore the correlation with T regulatory cell（Treg）／Th17 cytokines balance of decidua．M ethods：Twenty-three unexplained recurrent spontaneous abortion women were set as the abortion group，while 30 normal early pregnantwomen as the control group．Quantitative real-time PCR were employed to detect the expression of AhR，forkhead box p3（Foxp3），IL-10 and retinoic acid receptor-related orphan receptorsγ（ROR-γ）mRNA in decidua．The correlation of AhR mRNA with Foxp3，IL-10，ROR-γmRNA were analyzed．Results：The expression of AhR mRNA and ROR-γmRNA in decidua in abortion group was significantly higher than that in control group，while Foxp3 mRNA and IL-10 mRNA expression was significantly lower than the control group（both P＜0．05）．AhRmRNA expression was positively correlated with the level of ROR-γmRNA in two groups（P＜0．05）．However，AhR mRNA expression was not correlated with Foxp3 nor IL-10 mRNA expression in both two groups（both P＞0．05）．Conclusion：In decidua of unexplained spontaneous abortion，Th17 cytokines expression and AhR mRNA expression was increased，with Treg cytokines expression and the ratio of Treg／Th17 decreased，which indicated increasing AhR expression positively correlated with up-regulating Th17 cytokines．

spontaneous abortion；aryl hydrocarbon receptor；T regulatory cell；Th17

郭红玲（1968—），女，江苏扬州人，主任医师，硕士，主要从事复发性流产的研究；夏飞（通讯作者），主任医师，副教授，E-mail：feix0513＠126．com

R714．21

A

1671－7783（2014）05－0416－04

10．13312／j．issn．1671-7783．y140111

江苏省卫生厅课题资助项目（H201311）；苏州市临床重点病种诊疗技术专项项目（LCZX201302）

2014－04－21 ［编辑］ 刘星星