人脐带间充质干细胞原代培养方法的改良

李小战，马红，许辉，李淑，李遇梅

（江苏大学附属医院皮肤科，江苏镇江212001）

人脐带间充质干细胞原代培养方法的改良

李小战，马红，许辉，李淑，李遇梅

（江苏大学附属医院皮肤科，江苏镇江212001）

目的：探讨体外组织块培养原代人脐带间充质干细胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）的改良方法，并观察其形态，免疫表型，成脂成骨分化等生物学特性。方法：从健康足月儿获得脐带，将血管剥离后，余下的结缔组织剪成小块，分别用传统植块法和改良植块法分离培养原代hUC-MSCs。MTT法检测细胞增殖情况并绘制细胞生长曲线，流式细胞仪检测细胞免疫表型，成脂成骨诱导分化检测其分化潜能，化学染色鉴定诱导分化结果。结果：改良植块法脐带组织贴壁培养3～4 d即可从组织块边缘长出长梭形成纤维样原代细胞，5～6 d后细胞可长满80%，比传统植块法原代细胞培养周期缩短了一半以上时间，细胞传代后流水状或漩涡状生长，MTT法显示细胞增殖能力强，流式细胞仪检测提示CD90，CD105，CD73，CD166，CD29，CD44均阳性表达，阳性率均在95%以上，CD45和HLA-DR均阴性表达，阳性率低于2%；诱导分化实验及化学染色结果证实，该细胞具有成脂和成骨多向分化潜能。结论：应用与酶消化法相结合的改良植块法可以获得hUC-MSCs，比传统植块法缩短了原代培养周期，提高了细胞培养效率，所获得细胞贴壁生长，增殖能力强，表达间充质干细胞相关免疫表型，具有多向分化潜能，可在科研和临床应用中作为种子细胞来源。

脐带间充质干细胞；原代培养；诱导分化

间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSC）是中胚层来源的具有高度自我更新能力和多向分化潜能的多能干细胞［1－2］，可在体外培养扩增，并能在特定条件下分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞、神经细胞等［3－4］。自从Friedenstein等［5］从骨髓中发现MSC以来，研究人员目前已从全身多种组织如脐带、脐血、脂肪、肌肉等中分离获得MSC［6－7］，其中脐带来源的间充质干细胞（human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells，hUC-MSCs）因比骨髓取材容易等优点近几年来被广泛研究［8］。传统的植块法原代培养是直接将脐带组织块贴壁培养，缺点是培养时间较长［9］，分离效率低，且长时间的培养容易造成霉菌污染，无法满足临床或科研的需要。本实验对传统植块法进行改良，用Ⅰ型胶原酶、中性蛋白酶两种酶联合消化后再用植块法分离培养hUC-MSCs，并观察其生物学特性如细胞生长及增殖能力、细胞免疫表型、细胞成脂成骨分化潜能。

1 材料与方法

1．1 材料

脐带标本取自江苏大学附属医院妇产科足月剖宫产健康产妇（均知情同意），标本6 h以内处理。所有产妇无系统性疾病且健康状况良好，术前签署知情同意书并经医院伦理委员会通过。

1．2 试剂与仪器

细胞培养基DMEM／F12（1∶1）（美国Hyclone公司），胎牛血清（美国Gibco公司），T25培养瓶，6孔板（美国Corning公司），胰蛋白酶（Gibco公司），Ⅰ型胶原酶（美国Sigma公司），中性蛋白酶（美国Sigma公司），青霉素、链霉素（山东鲁抗医药股份有限公司），维生素C、β-甘油磷酸钠、1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤（IBMX）、地塞米松、吲哚美辛、胰岛素（美国Sigma公司），油红O（上海迈坤化工有限公司），茜素红S（南京宁试化学有限公司），抗人抗体CD90-PE、CD166-PE、HLA-DR-PE、CD105-PE、CD45-PE，CD44-FITC、CD29-FITC、CD73-FITC以及阴性对照IgG1-PE，IgG2a-FITC（美国eBioscience公司），流式细胞仪（美国BD公司），酶联免疫检测仪（澳大利亚Clinibio公司）。

1．3 方法

1．3．1 hUC-MSCs分离与原代培养

1．3．1．1 传统植块法 人脐带在手术台获取后无菌条件下浸没于含1%双抗（青链霉素）的DMEM／F12（1∶1）培养基中，玻璃容器密封无菌运送至实验室。在超净工作台内取出，用0．9%生理盐水涮洗2次，去除两端有瘀血的部分，用含1%双抗的PBS缓冲液充分冲洗脐带外周以及脐静脉内腔，剔除动静脉血管，取脐带基质，剪成4～5 mm3大小的组织块，分别接种于含有1 mL DMEM／F12培养基（含10%FBS）的T25培养瓶中，每瓶放5块，共放置10瓶，置于37℃、体积分数为5%的CO2饱和湿度细胞培养箱内培养，24 h后首次换液，以后每2～3 d更换培养基，细胞长出至80%融合时去除组织块，0．25%胰蛋白酶（含0．02%EDTA）消化传代培养，同时细胞计数，计算原代培养获得的细胞数目。

1．3．1．2 改良植块法 取脐带结缔组织剪成4～5 mm3大小的组织块，预先加入0．1%的Ⅰ型胶原酶和0．1%中性蛋白酶，于37℃孵育消化1 h，加入等量体积的DMEM／F12培养基停止消化；1 000 r／min离心10 min，弃上清过滤后，留下组织块，接种于含有1 mL DMEM／F12培养基（含10%FBS）的T25培养瓶中，每瓶放5块，共放置10瓶，置于37℃、5%的CO2饱和湿度细胞培养箱内培养，2 d后首次换液，以后每2～3 d换液，细胞长出至80%融合后去除组织块，胰酶消化传代，同时细胞计数，计算原代培养获得的细胞数目。

1．3．2 hUC-MSCs传代培养 使用0．25%胰蛋白酶消化后显微镜下观察到细胞变圆以及部分细胞脱落时，弃胰酶并加完全培养基终止消化，吹打底部收集脱落细胞于离心管中，800 r／min离心5 min，弃上清，重复洗涤2遍，细胞沉淀用DMEM／F12培养基（含10%FBS）重悬后接种于T25细胞培养瓶中，于细胞培养箱内培养，2 d后观察到细胞贴壁后换液，以后每2～3 d换液1次。

1．3．3 细胞增殖及生长曲线的绘制 改良植块法获得的细胞使用MTT法，对P3，P5，P8代细胞用DMEM／F12培养基（含10%FBS）调整细胞密度为1×104个／mL，接种于8个96孔板，每板设3个复孔，每孔200μL；另设3孔对照，加200μL PBS。接种后置于37℃、5%CO2培养箱中培养24 h后，连续8 d每天固定时间取出一块板，每孔加入MTT溶液（浓度5 mg／mL）20μL，培养箱孵育4 h后弃上清，每孔加入150μL二甲基亚砜（DMSO），摇床振荡10 min，用酶标仪以490 nm波长检测各孔光密度（D）值，代表细胞的相对数量，绘制其随时间而变化的生长曲线。

1．3．4 细胞免疫表型检测 改良法获得的第3代hUC-MSCs经胰蛋白酶消化后调整细胞密度为105／mL的单细胞悬液，分别加入抗人抗体CD90-PE、CD166-PE、HLA-DR-PE、CD105-PE、CD45-PE，CD44-FITC、CD29-FITC、CD73-FITC以及阴性对照IgG1-PE，IgG2a-FITC，4°避光孵育30 min，流式细胞仪检测细胞表面抗原。

1．3．5 成脂诱导分化 改良法获得的第3代hUCMSCs以l×105／mL的密度接种于6孔板中，使用DMEM／F12培养基（含10%FBS）培养细胞，至贴壁生长达80%融合时，选其中3孔为成脂诱导组，换为成脂诱导培养基（含高糖DMEM，10%FBS，100 mg／L 1-甲基-3-异丁基-黄嘌呤，1μmol／L地塞米松，50μmol／L吲哚美辛，10μmol／L胰岛素，100 U／mL青霉素和100 mg／L链霉素）。另3孔为对照组，仍使用DMEM／F12培养基。诱导期间每隔2～3 d换液1次，镜下观察细胞形态变化及脂滴形成情况。第14天后油红染色鉴定脂滴的生成。

1．3．6 成骨诱导分化 改良法获得的第3代hUCMSCs以l×105／mL的密度接种于6孔板中，3孔为成骨诱导组，3孔为对照组。使用DMEM／F12培养基培养细胞生长达80%融合时，成骨诱导组改用成骨诱导培养基（含高糖DMEM，10%FBS，1．0μmol／L地塞米松，200μmol／L抗坏血酸，10μmol／Lβ-磷酸甘油，100 U／mL青霉素和100 mg／L链霉素）。对照组继续使用DMEM／F12培养基培养。每隔2～3 d换液1次，培养14 d后用茜素红S染色鉴定钙结节的生成。

1．4 统计学分析

2 结果

2．1 hUC-MSCs的原代培养及传代培养

传统植块法培养约11～12 d可见成纤维样原代细胞长出，部分形成小的集落，细胞呈纺锤形贴壁生长，15～16 d后细胞即长满80%（图1）。改良植块法培养约3～4 d左右可见长梭形的成纤维样细胞从组织块边缘游离出来，细胞在组织块厚的地方分布密集，组织块薄的地方分布稀疏，约5～6 d后细胞达到80%融合（图1），胰酶消化传代培养，细胞呈长梭形流水状生长（图2）。不同分离方法原代培养hUC-MSCs的效率比较见表1，从该表中可看出，改良法细胞从组织中游离出的时间以及达到80%细胞融合的时间比传统法明显缩短，差异有统计学意义（P＜0．05），但在获得的原代细胞数上，两者无明显差异（P＞0．05）。

2．2 细胞生长曲线

改良法获得的P3，P5，P8代hUC-MSCs生长曲线显示，细胞接种后0～2天处于潜伏期，第3天进入对数增长期，维持至第6天；之后进入平台期，显示出很强的增殖能力（图3），不同代数hUC-MSCs的增殖无明显差异。

2．3 细胞免疫表型

改良法第3代hUC-MSCs经流式细胞仪检测，结果显示，干细胞标志物CD90，间质标志物CD 105，CD73，黏附分子CD29，CD166，CD44均阳性表达，阳性率均在95%以上；白细胞标志物CD45、主要组织相容性抗原HLA-DR均阴性表达，阳性率不高于2%（图4）。

2．4 细胞成脂成骨诱导分化

成脂诱导7 d后，诱导组细胞由长梭形变为椭圆形或圆形，光镜下可见部分细胞胞质内有透亮的脂滴形成，之后脂滴数目逐渐增加，第14天油红染色可见脂滴被染成鲜红色；对照组光镜下未见脂滴形成，油红染色亦未见鲜红色脂滴（图5）。成骨诱导5～6 d后，诱导组可见细胞形态由长梭形变为多角形，2周后行茜素红染色，可见红色矿化的钙结节形成；对照组染色无红色矿化的钙结节形成（图5）。

3 讨论

近年来，hUC-MSCs以其原始性强，来源丰富，低免疫原性［10］，相对纯净污染少，多向分化潜能［2－4］等诸优点受到了越来越多的关注。目前，hUC-MSCs主要是从脐带结缔组织获取，但不同实验室有不同的分离和培养方法［11］，主要有酶消化法和组织块贴壁法。酶消化法是利用胶原酶或胰蛋白酶将脐带中的胶质降解，从而使细胞分离出来。酶消化法可在短时间内获得脐带原代细胞，但操作步骤复杂，极易对细胞产生化学污染和机械损伤，并且酶的浓度及消化时间不好掌握，且使用的胶原酶价格昂贵，因此不适合规模化生产。

传统组织块贴壁法主要利用脐带组织中hUCMSCs对塑料培养瓶较强的黏附能力，将其在组织块贴壁培养过程中逐步迁移出来，而组织块中内皮细胞及造血系细胞等不贴壁，可以在换液过程中被逐渐弃去。该方法步骤简单，减少了细胞机械损伤和化学污染的概率，能更好地保持细胞的活力，同时省去了酶的使用，减少了经济成本，也适合规模化生产，因此传统植块法比酶消化法有更多的优点。但是传统植块法的缺点是培养时间较长，从植块到传代约需要14～20 d不等［9］，分离效率低，很难在短时间内获得大量hUC-MSCs。

脐带结缔组织中富含各种胶原蛋白以及层黏连蛋白，本实验预先使用Ⅰ型胶原酶消化胶原蛋白，中性蛋白酶降解层黏连蛋白，降低了脐带华通氏胶的黏稠性，使组织块更容易贴壁，更有利于hUC-MSCs从组织块长出。实验结果证明，改良植块法贴壁3～4 d即可长出原代细胞，5～6 d后长满80%即可传代，比传统的单纯植块法缩短了一半以上的时间，获得的细胞呈长梭形或纺锤形，传代后细胞呈旋涡状或流水状生长。

到目前为止，hUC-MSCs没有可以作为鉴别标准的特异性细胞抗原标志［12］。我们检测了部分细胞免疫表型：干细胞标志物CD90，间质标志物CD 105，CD73，黏附分子CD29，CD166，CD44均阳性表达，阳性率均在95%以上，血细胞及内皮细胞相关标志物CD45、主要组织相容性抗原HLA-DR均阴性表达，阳性率低于2%；同时结合细胞贴壁生长的特性，成骨成脂诱导分化证实其具有多向分化的潜能。以上这些生物学特性符合国际细胞治疗协会制定的最低间充质干细胞标准［13］，因此我们认为分离得到的是非血细胞非内皮细胞的hUC-MSCs。

目前，hUC-MSCs因众多优点成为最具有应用潜能的种子细胞之一，本实验结合了酶消化法的优点，改良了组织块贴壁法，建立了一种高效的hUCMSCs原代分离培养方法，这些结果为其在科研和临床中应用提供了依据。

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Im proved primary cultivation of human umbilical cord mesenchymal stem cells

LIXiao-zhan，MAHong，XU Hui，LIShu，LIYu-mei
（Department of Dermatology，the Affiliated Hospital of Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212001，China）

Objective：To improve the tissuemass primary culture protocol of human umbilical cord-derived mesenchymal stem cells（hUC-MSCs），so as to explore theirmorphology，cell surfacemarkers，osteogenic and adipogenic differentiation potential and observe biological properties．M ethods：Human umbilical cordswere obtained from healthy full-term delivered newborns．After stripping off blood vessels，the remaining connective tissueswere cut into small fragments，and primary hUC-MSCs were separated by culture of traditional and improved tissue explants methods．The hUC-MSCs were tested with MTT method and the growth curves of them were drawn．Cell surfacemarkerswere detected by flow cytometry．After osteogenic and adipogenic differentiation，the potentiality of their differentiation was detected by chemistry staining．Results：After 3－4 days of incubation，flat or spindle-shaped fibroblast-like primary cellswere presented，and cells reached 80%confluence after 5－6 days of incubation．Culture period was shortened by more than half．Flowing water-like or spiral growth morphology was presented after cell passage．MTT revealed high capability of proliferation．Flow cytometry analysis showed CD90（＋），CD105（＋），CD73（＋），CD166（＋），CD44（＋），CD29（＋），positive rate of95%ormore；CD45（－），HLA-DR（－），negative rate of notmore than 2%．Its differentiation potential was proved by osteogenic and adipogenic differentiation，which was proved by chemistry staining．Conclusion：An improved primary culture method of hUCMSCs has been developed．Primary cells can be obtained from improved tissue explantsmethod combined enzyme digestion technique．Primary cell culture time was shortened，and the efficiency of cell culture wasimproved．Cells isolated by the new method from the human umbilical cords had the following biological characteristics：adherent growth，high proliferation，mesenchymal stem cell phenotype，and multipotent differentiation．They could be used as the source of seed cells in scientific research and clinical applications．

hUC-MSCs；primary cultivation；induced differentiation

R329．2

A

1671－7783（2014）05－0375－05

10．13312／j．issn．1671-7783．y140204

国家自然科学基金资助项目（30972663）

李小战（1980—），男，硕士研究生；李遇梅（通讯作者），副教授，硕士生导师，E-mail：l．yumei＠aliyun．com

2014－06－14 ［编辑］ 陈海林