薯蓣皂苷元体内外抑制胃癌增殖的机制

霍中华，胡君，储著陵，吕胜，尹鹏，章丽

（解放军第454医院普外科，江苏南京210002）

薯蓣皂苷元体内外抑制胃癌增殖的机制

霍中华，胡君，储著陵，吕胜，尹鹏，章丽

（解放军第454医院普外科，江苏南京210002）

目的：研究薯蓣皂苷元抑制胃癌增殖及转移的主要途径及其机制。方法：分别使用1，10，100μg／mL浓度薯蓣皂苷元处理人血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）和胃癌BGC-823细胞，制作细胞生长曲线，观察薯蓣皂苷元对细胞增殖能力的影响；选取一定浓度的薯蓣皂苷元处理HUVEC和BGC-823细胞，体外成管实验和划线法分别检测药物处理对血管内皮细胞成管能力及肿瘤细胞迁移能力的影响。将BGC-823细胞接种到裸鼠制作皮下肿瘤模型，连续静脉注射薯蓣皂苷元，分析比较其对皮下肿瘤的抑制效果。结果：与对照组比较，薯蓣皂苷元可明显抑制内皮细胞增殖活性（P＜0．05），且具有浓度依赖性；而相同处理方式对BGC-823细胞的增殖活性基本无影响；10μg／mL的薯蓣皂苷元对BGC-823细胞的迁移能力具有明显的抑制作用，能够明显抑制HUVEC细胞体外成管能力；与模型组比较，薯蓣皂苷元给药组肿瘤抑制率明显增高（达38．2%），差异有统计学意义（P＜0．05）。结论：薯蓣皂苷元可以通过抑制内皮细胞增殖活性影响肿瘤血供，并最终抑制皮下肿瘤模型的增殖，同时，其可通过直接的作用抑制胃癌的迁移。

薯蓣皂苷元；人血管内皮细胞；BGC-823细胞；增殖活性；体外成管；迁移；裸鼠成瘤

胃癌的发病率近年来呈现年轻化、扩大化的趋势，然而多年来，其治疗手段却没有根本性的改变［1］，外科手术配合化学疗法是目前胃癌治疗的主要手段。手术疗法受到患者具体情况的限制，化学疗法也始终伴随着严重的不良反应。化学药物的大量长期使用，还有可能导致染色体畸形，具有脏器损害及致畸等潜在危险。因此，近年来天然植物成分逐渐成为抗肿瘤领域研究的热点。薯蓣皂苷是从薯蓣科植物穿龙薯蓣的根中分离出的一种植物甾体化合物，其抗癌活性首先发现于云南白药［2］。而Chiang等［3］则通过实验证实从紫花茄中提取的薯蓣皂苷对结肠癌、鼻咽癌、宫颈癌等多种肿瘤细胞具有抑制作用。王丽娟等［4］研究了薯蓣皂苷在体内外的抗肿瘤作用，结果发现其对肉瘤、肝癌、宫颈癌细胞及裸鼠皮下移植瘤均有明显抑制作用。HU等［5］则系统观察了薯蓣皂苷元的抗癌作用，发现薯蓣皂苷元对大多数血癌和实体瘤都表现出抑制活性。近期研究发现，薯蓣皂苷元可以抑制多种肿瘤细胞的侵袭和转移能力［6－8］，这种抑制能力可能是通过抑制缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factor 1-alpha，HIF1-α）的活性实现的［9－10］。

薯蓣皂苷元对血管内皮细胞（human umbilical vein endothelial cells，HUVEC）的影响，以及是否通过对血管生成的影响进而影响肿瘤的形成及发展过程，目前未见有详细报道。本研究比较了薯蓣皂苷对血管内皮细胞和胃癌细胞生物学功能的影响，且建立了裸鼠胃癌模型，初步分析薯蓣皂苷是否通过影响血管生成进而影响胃癌形成和发展，以及可能存在的作用机制。

1 材料与方法

1．1 材料

HUVEC细胞购自上海肯强生物科技有限公司，BGC-823细胞购于中科院细胞所；基质胶、细胞培养耗材为BD公司产品；胎牛血清，0．25%胰蛋白酶，RPMI-1640培养基均为Invitrogen公司产品；CCK-8细胞活性检测试剂盒为日本同仁化学研究所产品；细胞培养箱为日本三洋公司产品，移液器、离心机为Eppendorf公司产品；酶标仪为Thermo公司产品；裸鼠购于上海斯莱克实验动物有限公司；倒置显微镜为Olympus公司产品；薯蓣皂苷元为美国圣克鲁斯生物技术公司产品。

1．2 方法

1．2．1 薯蓣皂苷元对胃癌BGC-823细胞及HUVEC增殖活性的影响 取对数生长期BGC-823及HUVEC细胞，胰酶消化法制备细胞悬液，血细胞计数板计数活细胞，使用添加10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基调整细胞密度至1×105个／mL，接种细胞至96孔细胞培养板，每孔100μL细胞悬液。实验分为对照组和实验组，其中实验组培养基中加入终浓度为1、10和100μg／mL的薯蓣皂苷元。接种后正常条件培养24、48及72 h，CCK-8检测细胞活性。每孔加入10μL的CCK-8溶液，置于37℃和5%CO2培养箱内继续培养4 h，用酶标仪测定450 nm处的光密度值。

1．2．2 薯蓣皂苷元对BGC-823细胞迁移能力的影响 取对数生长期BGC-823细胞，胰酶消化法制备细胞悬液，台盼蓝染色后使用血小球计数板计数活细胞数，使用完全培养基（RPMI-1640＋10%FBS）调整细胞密度为1×105个／mL，接种细胞到6孔板，每孔添加2 mL细胞悬液，37℃和5%CO2浓度下培养24 h，使用无菌200μL枪头划痕，无血清培养液冲洗2次，加入不含血清的培养液2 mL，正常条件培养；划线后24、48和72 h分别进行显微镜摄影，观察细胞迁移状况。实验分为对照组和实验组，其中实验组培养基中加入终浓度为1、10和100μg／mL的薯蓣皂苷元。

1．2．3 薯蓣皂苷元对HUVEC成管的影响 实验的前1天，将基质胶置于4℃融化，同时将灭菌的10μL枪头、24孔细胞培养板置于4℃冷藏备用。实验时，从冰箱中取出冷藏的枪头和培养板，在培养板每个孔中加入100μL基质胶，注意保持枪头垂直于孔中间位置，基质胶一直保持放在冰上。轻晃培养板使胶分布均匀，将培养板放入培养箱中，放置30 min使胶凝固。在胶凝固的过程中，可以开始准备细胞悬液，细胞消化后将细胞悬液密度调整到2×105个／mL。从培养箱中取出培养板，每孔加入50μL细胞悬液，盖上盖子后放入培养箱培养，6 h后进行显微镜摄影，每组任选5个视野，计算其中闭合状结构的数目，求取平均值后进行组间比较。

1．2．4 薯蓣皂苷元对胃癌细胞裸鼠模型的影响取对数生长期BGC-823细胞，胰酶消化法制备细胞悬液，1 000×g离心2 min收集沉淀，使用DPBS重悬细胞2次，再用DPBS制备细胞悬液，台盼蓝染色后使用血细胞计数板进行活细胞计数，并使用DPBS调整细胞密度至1×108个／mL，冰浴保存。无菌1 mL注射器吸取0．1 mL细胞悬液，接种到5周龄裸鼠腋下。接种后第10天，皮下可见有瘤体形成，直径约2．5 mm。给药组通过尾静脉注薯蓣皂苷元，每次用量为50 mg／kg（根据临床人体使用量的10倍给药），每2天注射1次，直至接种后第4周，共注射7次。拉颈处死小鼠，剥离肿瘤（去掉瘤体上的脂肪及血管、淋巴管组织），进行瘤体称重，计算肿瘤抑制率。

1．3 统计学处理

采用SPSS 13．0统计软件分析，数据结果采用均数±标准差表示，采用析因分析进行组间差异及组内差异的比较。P＜0．05为差异有统计学意义。

2 结果

2．1 薯蓣皂苷元对胃癌细胞及HUVEC增殖活性的影响

比较不同处理组细胞生长曲线发现，1，10，100μg／mL的薯蓣皂苷元可明显抑制HUVEC细胞增殖活性，且具有浓度依赖性；其中48和72 h，与对照组比较，差异具有统计学意义（P＜0．01或P＜0．05）；而同样浓度的薯蓣皂苷元处理，对BGC-823增殖活性则无明显影响。见图1。

2．2 薯蓣皂苷元对胃癌细胞BGC-823迁移能力的影响

按照前面的活性抑制实验，选择最低有效浓度10μg／mL的薯蓣皂苷元进行迁移实验。通过比较同一视野细胞向线内迁移的速度，发现薯蓣皂苷元能明显抑制BGC-823细胞的迁移能力。见图2。

2．3 薯蓣皂苷元对HUVEC体外成管的影响

HUVEC经10μg／mL的薯蓣皂苷元处理后，与对照组比较，成管数量明显降低，差异具有统计学意义（χ2＝2．91，P＜0．05）。结果显示，薯蓣皂苷元可明显抑制HUVECDE成管能力。见图3

2．4 薯蓣皂苷元对裸鼠皮下胃癌模型的影响

与模型组比较，给药组肿瘤明显受到抑制，其抑制率达到38．2%（χ2＝3．31，P＜0．05）；盐水对照组与模型组比较，抑制率无明显差异。见图4。

3 讨论

肿瘤从某种意义上来说是系统疾病的局部表现，使用单一的疗法，很难根治。而以目前肿瘤治疗的主要手段来看，手术切除、化疗放疗均会产生比较明显的不良反应。另外，术后复发的问题也一直困扰着医疗人员和患者。天然药物因其低毒副作用，可以作为肿瘤治疗和辅助治疗的有效药物。近年来发现多种植物及其有效成分具有抑制肿瘤的作用。如人参苷具有预防肿瘤、抗氧化、参与受损伤细胞修复和再生、肿瘤生物学逆转等作用。

薯蓣皂苷元抗肿瘤的主要途径是通过对多种细胞内信号通道、肿瘤特异性因子以及一些与肿瘤生长、分化、凋亡和变异相关的分子进行调控，从而对肿瘤的发生发展进行控制［11］。Moalic等［12］的研究发现薯蓣皂苷元在人类骨肉瘤pression 1547细胞中有抑制COX-2的活性和蛋白表达的作用。Raju等［13］研究发现，薯蓣皂苷元也可以通过干扰细胞HMG-CoA还原酶的胆固醇生物合成途径，诱导HCT-116细胞的凋亡，并且存在剂量依赖性。薯蓣皂苷对正常乳腺上皮细胞没有明显的毒性，所以其对肿瘤细胞的毒性可能是特异性的［7］。薯蓣皂苷元在体内和体外均能诱导人结肠癌HT-29及畸变隐窝灶细胞凋亡，可能是通过抑制bcl-2及诱导caspase-3蛋白的表达实现的［14］。

本研究中，我们使用薯蓣皂苷元同时处理了胃癌BGC-823细胞及HUVEC，细胞活性检测数据表明，相同浓度的薯蓣皂苷对内皮细胞增殖活性具有明显的抑制作用，而对BGC-823细胞的增殖活性基本无影响。裸鼠体内移植肿瘤抑制实验表明，薯蓣皂苷元能够明显抑制移植瘤的生长，这与体外实验的结果明显不同。因此，我们认为薯蓣皂苷元对BGC-823的增殖不产生直接影响，其对体内肿瘤增殖的抑制作用，应该是通过抑制肿瘤内血管的生成，从而影响肿瘤的血供实现的。在本研究中，我们还进行了细胞迁移检测，结果发现薯蓣皂苷能明显抑制BGC-823细胞的迁移能力。体外实验结果表明，薯蓣皂苷抑制胃癌细胞迁移能力与其抑制细胞增殖活性之间是没有相关性的。

综上所述，薯蓣皂苷元具有较好的抗肿瘤作用，其对胃癌生长的抑制机制不是单纯的通过对肿瘤细胞的杀伤作用而实现的，可能是多途径的。因此我们认为薯蓣皂苷元作为化疗的辅助用药可增加化疗药的治疗效果，符合未来中药的发展方向。鉴于其对胃癌细胞本身并无明显抑制作用，因此可减少对癌旁组织和细胞的损伤。尽管它与抗肿瘤有关的途径不断被发现，但其通过抑制血管生成而影响体内肿瘤生长途径对我们后续的研究仍然具有积极的意义，如在筛选肿瘤抑制药物时，不能将细胞活性作为唯一的参考标准，而对抗血管生成药物的研究，则可以为胃癌临床治疗中，尽可能减少对癌旁组织的损伤提供了新的思路。

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M echanism underlying inhibition ofm igration of gastric carcinoma by diosgenin in vitro and vivo

HUO Zhong-hua，HU Jun，CHU Zhu-ling，LV Sheng，YIN Peng，ZHANG Li
（Department of General Surgery，the 454th Hospital of PLA，Nanjing Jiangsu 210002，China）

Objective：To investigate the principal pathway and preliminarymechanism by which diosgenin inhibits gastric carcinoma in vivo by treatment of human umbilical vein endothelial cells（HUVEC）and gastric carcinoma（BGC-823）cells for comparison．M ethods：HUVEC and BGC-823 cells were treated with diosgenin at different concentrations and cell growth curveswere plotted to observe the effects of diosgenin on proliferative activities of endothelial cells and gastric carcinoma cells；the scraping linemethod and canalization in vitro were used to detect the effects of diosgenin treatment on canalization of endothelial cells and migration ability of gastric carcinoma cells by treating HUVEC and BGC-823 cells with diosgenin at a certain concentration；a subcutaneous tumormodel was established by inoculating nudemice with BGC-823 cells and diosgenin was administrated continuously to analyze its inhibitory effects on subcutaneous tumors．Results：Diosgenin had a significant effect on proliferation of endothelial cells in a concentration-dependent way，with a significant difference between the treatment groups and the control group at 48 or 72 h（P＜0．05）；and the same treatment had no evident effect on the proliferative activity of BGC-823 cells and effectively inhibited themigration of BGC-823 cells and significantly reduced the canalization of HUVEC cells in vitro；diosgenin exhibited a good inhibitory effect on subcutaneous tumors in the nudemicemodel of BGC-823 cells at an inhibitory rate of38．2%（P＜0．05）in comparison with themodel group．Conclusion：Diosgenin can eventually inhibit the proliferation of the subcutaneous tumormodel by suppressing endothelial cell activity and consequently suppressing blood supply．

book=395,ebook=32

diosgenin；human umbilical vein endothelial cells；BGC-823 cell；viability；capillary like tube formation；cellularmigration；nudemouse transplantation tumor

R979．19

A

1671－7783（2014）05－0394－05

10．13312／j．issn．1671-7783．y140213

霍中华（1970—），男，安徽太和人，主任医师，博士，主要从事消化道肿瘤的诊治研究。

2014－07－29 ［编辑］陈海林