Tbxa2r基因敲低对嘌呤霉素氨基核苷诱导的足细胞凋亡的影响

邓振兴，孔维信，张林，孙怀鑫，丁露露

（1．江苏大学临床医学院，江苏镇江212001；2．上海交通大学医学院苏州九龙医院肾内科，江苏苏州215021）

Tbxa2r基因敲低对嘌呤霉素氨基核苷诱导的足细胞凋亡的影响

邓振兴1，2，孔维信2，张林2，孙怀鑫2，丁露露2

（1．江苏大学临床医学院，江苏镇江212001；2．上海交通大学医学院苏州九龙医院肾内科，江苏苏州215021）

目的：观察足细胞血栓素A2受体（Tbxa2r）基因敲低对嘌呤霉素氨基核苷（puromycin aminonucleoside，PAN）诱导的足细胞凋亡的影响。方法：通过目标序列设计4条siRNA，评价细胞转染效率后，RT-PCR检测siRNA干扰效果，蛋白质印迹法检测Tbxa2r蛋白表达，流式细胞仪检测PAN诱导的MPC5足细胞的凋亡情况。结果：目标序列在转染24 h后几乎没有干扰效果，而在48 h时第3条siRNA（Tbxa2r-mus-1677）干扰序列作用效果最好；在干扰72 h后，Tbxa2r蛋白表达量明显降低。PAN刺激48 h后，空白组与阴性对照组MPC5足细胞没有明显的凋亡现象，阳性对照组与Tbxa2r基因敲低PAN组细胞凋亡和坏死现象明显。结论：PAN能促进Tbxa2r基因敲低的足细胞发生凋亡和坏死。

足细胞；血栓素A2受体；细胞凋亡

血栓素A2（Thromboxane A2，TXA2）是花生四烯酸代谢过程中生成的具有很强生理活性的产物［1－2］，其与特异TXA2受体（TP受体或Tbxa2r）结合，诱导血小板聚集，收缩血管，参与血管紧张素Ⅱ依赖的高血压的发生、糖尿病肾病的进展、内毒素性小鼠及5／6肾大部切除肾衰竭的发生［3］。

研究表明，多柔比星能选择性增加小鼠肾小球足细胞前列腺素E2（PGE2）受体亚型EP4及Tbxa2r的表达［4］。将过表达足细胞环氧合酶2（COX-2）的转基因小鼠与Tbxa2r基因敲除小鼠杂交，则其后代对多柔比星损伤增加的敏感性可以逆转；而将足细胞过表达COX2的转基因小鼠选择性敲除足细胞EP4基因，并未对足细胞起保护作用［5］。推测Tbxa2r可能与COX2过表达的足细胞损伤有一定关联。但Tbxa2r基因敲除对足细胞的影响尚无体外实验报道。因此，我们采用Tbxa2r特异性小干扰RNA（small interfering RNA，siRNA）技术将足细胞Tbxa2r基因敲除或敲低，观察嘌呤霉素氨基核苷（puromycin aminonucleoside，PAN）对其凋亡的影响。

1 材料和方法

1．1 主要试剂

RPMI 1640培养基、10%胎牛血清、Trizol、重组γ-干扰素（γ-IFN）购自美国Sigma公司；反转录试剂盒和Taq DNA聚合酶、转染试剂Metafectene购自德国Biontex公司；兔抗小鼠Tbxa2r多克隆抗体、FITC标记的羊抗兔IgG和TRITC标记的羊抗兔IgG购自美国KPL公司；小鼠抗大鼠3磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）多克隆抗体、HRP标记的羊抗兔IgG、兔抗羊IgG、羊抗小鼠IgG购自上海华美生物工程公司。

1．2 足细胞培养

条件永生性小鼠足细胞（MPC5）由美国Mount Sinia医学院Peter Mundel教授馈赠。参照文献［6］方法进行培养。

1．3 目标序列的设计

Tbxa2r基因（Accession：NM＿009325．3，GI：142378599）序列从mRNA的AUG起始密码开始，寻找“AA”序列，并记下其3′端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。研究显示，GC含量在30%～50%左右的siRNA要比GC含量偏高的更为有效［7］。用软件Genepharma Designer 2．0辅助设计4条干扰序列，见表1。

1．4 足细胞转染效率评价实验

干扰效果的好坏取决于siRNA进入细胞的数量和siRNA本身的性质，即细胞转染效率评价。针对小鼠MPC5足细胞，由于不能判断该细胞是否能进行脂质体转染，在实验前先进行转染效率的评估。将荧光素FAM标记的siRNA以一定比例与阳离子脂质体混合，分别为0．25μL脂质体＋10 pmol siRNA，0．5μL脂质体＋10 pmol siRNA，0．5μL脂质体＋20 pmol siRNA。具体参照文献［8］。

1．5 siRNA的转染

参照文献［9］。

1．6 总RNA的提取

弃培养液，每孔加入500μL Trizol，吹打细胞至完全裂解，转移至EP管中，室温放置10 min。加入100μL氯仿，剧烈振荡混匀，室温放置10 min。12 000×g，4℃离心10 min，取上清液至新EP管中，加入等体积异丙醇，室温沉淀10 min。12 000× g，4℃离心15 min，弃上清。500μL 75%乙醇洗涤1次。12 000×g，4℃离心5 min，弃上清。常温倒置晾干10 min。加入20μL DEPC溶解沉淀，测D（260 nm）、D（280 nm），计算RNA浓度。琼脂糖电泳检测RNA的完整性。

1．7 RT-PCR检测基因扩增

1．7．1 反转录反应体系 引物序列见表2。5×反转录缓冲液4μL，引物1．2μL（1μmol／L），RNA模板5μL，MMLV反转录酶0．2μL（200 U／μL），DEPC双蒸水定容至20μL。42℃温育45 min，85℃加热10 min终止反应，冰上骤冷，反应液用作PCR模板。

1．7．2 内参GAPDH和目标基因Tbxa2r反应体系2×RT-PCR混合物10μL，上、下游引物各0．1 μL（20μmol／L），cDNA模板2μL，r Taq DNA聚合酶0．4μL（5 U／μL），双蒸水定容至20μL。1．7．3 反应条件 95℃变性3 min，95℃30 s，62℃40 s，共40个循环。

1．8 蛋白质印迹法检测蛋白表达

参照文献［9］。

1．9 流式细胞术检测细胞凋亡

细胞随机分为4组，即空白对照组、阴性转染组、阴性转染PAN组、Tbxa2r基因敲低PAN组。后2组各加入100μg／mL PAN刺激48 h，然后流式细胞仪检测各组细胞的凋亡情况。

2 结果

2．1 MPC5足细胞转染效率评价

通过荧光显微镜的观察，判断siRNA进入细胞的数量及细胞的生长状态，结果显示，当用0．25μL Lipo 2000／10 pmol siRNA转染细胞时，转染效率约为70%，此时细胞状态与正常细胞基本一致，说明该浓度的转染对细胞基本没有影响；当用0．5μL Lipo 2000／10 pmol siRNA或0．5μL Lipo 2000／20 pmol siRNA转染时，此时细胞出现皱缩或脱落，说明该浓度对细胞的生长影响较大，故采用0．25μL Lipo 2000／10 pmol siRNA进行下一步转染实验。见图1。

2．2 目标序列的转染及RT-PCR检测干扰效果

2．2．1 PCR检测干扰后的RNA 转染试剂按照0．25μL脂质体＋10 pmol siRNA的比列，将合成的4条siRNA（表1）转染MPC5细胞行干扰实验，在24 h和48 h收集细胞样品进行检测。PCR扩增产物的电泳结果见图2。各个基因均出现了扩增条带。

2．2．2 熔解曲线检测RT-PCR引物的特异性 结果如图3所示。Tbxa2r引物扩增产物的熔解温度为86～88℃，PPIA引物扩增产物的溶解温度为82～86℃，GAPDH引物扩增产物的熔解温度为86～ 88℃。熔解曲线和产物电泳图结果说明，所用PCR引物的特异性良好，扩增的产物为目标基因。

2．3 荧光定量PCR扩增曲线检测干扰效果

由荧光定量曲线起峰的结果可知，目标基因Tbxa2r的含量极低，荧光曲线起峰的位置在32个循环左右，而内参基因PPIA和GAPDH的起峰位置都在16个循环左右。结果显示，目标干扰序列在转染后24 h几乎没有干扰效果；48 h时，对照样品的起峰位置与24 h时相似，在30～32个PCR循环，而第3条siRNA（Tbxa2r-mus-1677）和第4条siRNA（Tbxa2r-mus-1884）干扰序列向后推迟了2个循环，起峰位置出现在32～34个循环，说明这两条siRNA对目标序列存在一定的干扰效果。见图4。

由计算结果得知，第3条siRNA（Tbxa2r-mus-1677）干扰48 h后2－ΔΔCt值最低，为0．18，所以，初步判定该干扰序列作用效果最好。干扰序列对内参基因的含量影响不大，PPIA相对GAPDH的含量无论是在24 h还是在48 h都没有受到影响。

2．4 蛋白质印迹法检测蛋白表达

由图5可知，GAPDH干扰质粒能降低GAPDH蛋白的表达量，但在48 h和72 h的相对表达量几乎无改变。

在干扰72 h后，Tbxa2r蛋白表达量降低，说明干扰片段在72 h后影响蛋白的表达。见图6。

蛋白质印迹结果与RT-PCR结果表明，第3条siRNA（Tbxa2r-mus-1677）在48 h时从mRNA水平下调mus-Tbxa2r的表达，在72 h时，从蛋白水平下调mus-Tbxa2r的表达。

2．5 PAN刺激后MPC5足细胞的凋亡情况

结果显示，空白组和阴性对照组细胞没有明显的凋亡现象；阳性对照组细胞凋亡明显增加，占23%，坏死细胞也大大增加，占19．5%。有效干扰片段组凋亡和坏死的细胞与阳性对照组相似，其中凋亡细胞约占28%，坏死细胞约为19．6%。以上结果说明，有效干扰片段在药物刺激时，能促进细胞的凋亡和坏死。见图7。

3 讨论

足细胞是一种高度分化的细胞，不具有增殖特性，其损伤或丢失可导致大量蛋白尿或肾小球硬化。

Tbxa2r广泛分布于不同组织器官的细胞膜及细胞内结构上，由7个跨膜区、3个细胞外袢和3个细胞内袢组成。Tbxa2r与其配体TXA2结合后，可以引起与受体偶联的G蛋白发生变构，引发细胞内一系列信息传递系统的变化而调节细胞代谢，引发血小板聚集和血管平滑肌收缩。研究表明，血栓素合成酶抑制剂或血栓素受体拮抗剂对链脲佐菌素诱导的肾损伤、狼疮性肾炎、环孢素肾毒性、残余肾及肾移植物排异均有疗效，但作用机制尚不明确［10］。

我们采用Tbxa2r siRNA技术，获得的siRNA和转染试剂的适当比例为0．25μL脂质体＋10 pmol siRNA，成功地转染进MPC5细胞进行干扰实验。细胞培养48 h后，再用PAN（100μg／mL）刺激48 h，Tbxa2r基因敲低PAN组细胞出现明显的凋亡和坏死，较阴性转染组稍高。空白组与阴性转染组细胞没有明显的凋亡现象。提示PAN可以诱导足细胞凋亡，Tbxa2r基因敲低可能加重足细胞的损伤；Tbxa2r是足细胞生存所依赖的，PAN的浓度、刺激时间及Tbxa2r的表达量与足细胞凋亡损伤的关系有待于进一步研究。

综上所述，采用Tbxa2r特异性siRNA技术，能成功地将足细胞Tbxa2r基因敲低，且其敲低可加重足细胞的损伤。

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Effect of Tbxa2r gene knockdown on podocytes apoptosis induced by purom ycin am inonucleoside

DENG Zhen-xing1，2，KONGWei-xin2，ZHANG Lin2，SUN Huai-xin2，DING Lu-lu2
（1．Clinical School of Medicine，Jiangsu University，Jiangsu Zhenjiang 212001；2．Department of Nephrology，Suzhou Kowloon Hospital，Shanghai Jiao Tong University，Jiangsu Suzhou 215201，China）

Objective：To observe the effectof podocytes Tbxa2r gene knockdown on podocytes apoptosis induced by puromycin aminonucleoside（PAN）．M ethods：The interference effect was detected by RTPCR after designing the target sequence and evaluating the cell transfection efficiency．The expression of Tbxa2r protein wasmeasured by western blotting．The apoptosis of MPC5 cells induced by PAN was tested by flow cytometry．Results：Target sequence after 24 h transfection almost had no interference effects，and after 48 h，the third siRNA（Tbxa2r-mus-1677）had the best interference effect；after 72 h transfection，Tbxa2r protein expression was significantly reduced．PAN stimulated for 48 h，no significant MPC5 podocyte apoptosiswere observed in the control group and negative control group，while there were significant apoptosis and necrosis in the positive control group and Tbxa2r gene knockdown PAN group．Conclusion：The PAN might facilitate the apoptosis and necrosis in Tbxa2r gene knockdown podocytes．

podocyte；Tbxa2r；cell apoptosis

R329．25

A

1671－7783（2014）05－0384－05

10．13312／j．issn．1671-7783．y130164

苏州市科技计划项目（SYSD2011070）；苏州工业园区孵化项目

邓振兴（1981—），男，山东德州人，硕士，住院医师，主要从事TXA-2与肾脏疾病关系的研究。孔维信（通讯作者），E-mail：weixinkong＠hotmail．com

2013－07－26 ［编辑］刘星星