四逆散含药血清诱导大鼠肝脏干细胞分化及其调控机制

徐卫东，钱元霞，高静，赵映前

（1．江苏大学药学院，江苏镇江212013；2．湖北中医药大学中医临床学院，湖北武汉430065）

四逆散含药血清诱导大鼠肝脏干细胞分化及其调控机制

徐卫东1，钱元霞1，高静1，赵映前2

（1．江苏大学药学院，江苏镇江212013；2．湖北中医药大学中医临床学院，湖北武汉430065）

目的：研究四逆散含药血清对大鼠肝脏干细胞分化的影响并探讨其治疗肝病的作用机制。方法：采用HPLC-MS-MS法，梯度洗脱，测定血清中四逆散的有效成分；以四逆散含药血清处理WB-F344细胞后，采用CCK-8法观察细胞增殖情况，血糖仪检测细胞培养液葡萄糖含量，乳酸测定试剂盒检测细胞中乳酸含量，荧光素 荧光素酶法检测ATP含量，蛋白质印迹法观察表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、纤维母细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor，FGFR）、转化生长因子受体（transforming growth factor beta receptor typeⅠ，TGF-βRⅠ）、肝细胞生长因子受体（hepatocyte growth factor receptor，HGFR）蛋白表达情况。结果：在四逆散血清中，检测到以原型入血芍药苷、橙皮苷等成分，并检测到橙皮素葡萄糖醛酸等部分代谢物。各浓度含药血清作用WB-F344细胞48 h后，对细胞均无毒性作用，10%含药血清显示出较好的促进细胞增殖的效果。随着药物血清作用时间的延长，WBF344细胞葡萄糖消耗量、乳酸生成量降低，ATP生成增加，EGFR、FGFR、TGF-βRⅠ、HGFR蛋白表达水平上升。结论：四逆散含药血清能够促进肝脏干细胞WB-F344的增殖并诱导其分化，分化机制可能与影响数种细胞因子受体的表达有关。

四逆散；肝干细胞；糖代谢；分化；细胞因子受体

四逆散始载于《伤寒论》，为东汉张仲景所创疏肝解郁的祖方，主治肝胃气滞，气机不利，阳郁于里，不能透达四末所致的四逆证。近代临床研究表明，四逆散对肝纤维化、乙醇性肝病、脂肪肝、肝炎等都有很好的疗效［1－4］。四逆散治疗肝病的机制与肝细胞保护、调节脂质代谢、对抗脂质过氧化、免疫调节等作用有关［5－8］，但有关其对干细胞的影响鲜有报道。

肝脏干细胞与肝细胞的生长、发育、增殖甚至纤维化程度等有着密切的关系［9－11］。卵圆细胞是肝干细胞的主要来源，被认为是原始的兼性多能干细胞，位于终末胆管，并可见于Hering管。在肝细胞再生能力不足等特定病理生理条件下，卵圆细胞可移行出门脉汇管区分化成肝细胞［12］，其数量与肝损伤的严重程度有关［13］。因此，卵圆细胞作为肝干细胞研究对象在肝脏疾病中的作用具有较好的实际价值。

本研究应用四逆散含药血清处理大鼠肝卵圆细胞系WB-F344，检测细胞糖代谢水平及细胞表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）、纤维母细胞生长因子受体（fibroblast growth factor receptor，FGFR）、转化生长因子受体（transforming growth factor beta receptor type I，TGF-βRⅠ）、肝细胞生长因子受体（hepatocyte growth factor receptor，HGFR）蛋白表达的变化，观察四逆散是否能够诱导细胞分化并探讨其机制。

1 材料与方法

1．1 材料

SPF级SD大鼠，雄性，体质量180～200 g，由江苏大学实验动物中心提供［许可证号：SCXK（苏）2009－0002］；大鼠肝干细胞WB-F344由中国医学科学院药物研究所李燕教授、陈晖老师惠赠，大鼠BRL肝细胞购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库；柴胡（批号：091211），白芍（批号：091109），枳实（炙）（批号：090701）购自安徽丰原铜陵中药饮片有限公司，甘草（炙）购自安徽海鑫中药饮片有限公司（批号：20110801）；对照品芍药苷（批号：110736-201136）、柚皮苷（批号：110722-2011 11）、橙皮苷（批号：110721-201115）、甘草次酸（批号：110723-200612）、柴胡皂苷d（批号：110778-201208）均购自中国药品生物制品检定所；乙腈（色谱纯）：国药集团化学试剂有限公司。

DMEM高糖培养基，优质胎牛血清（美国Gibco公司）；兔抗鼠EGFR、TGF-βRⅠ多克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；兔抗鼠HGFR、FGFR多克隆抗体（美国Bioworld公司）；细胞活性计数试剂盒CCK-8（日本Dojindo公司）；ATP检测试剂盒（碧云天生物工程公司）；乳酸测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。

LC-20A高效液相色谱仪（日本岛津Prominence）；液相色谱 离子阱质谱联用仪配备电喷雾离子源（美国Thermo Fisher Scientific公司）；525BR电泳仪（美国Bio-Rad公司）；TS100 Nikon倒置相差显微镜（日本尼康公司）；MD Spectra Max 190酶标仪（美国MD公司）。

1．2 方法

1．2．1 四逆散药剂的制备 按四逆散处方等比例取炙甘草（6 g）、枳实（6 g）、柴胡（6 g）、白芍（6 g）药材，加水10倍浸泡3 h，煎煮2次（第1次8倍量，第2次6倍量），每次1 h，分离药渣。将所有药液混匀浓缩至0．4 g／mL，合并滤液，置于4℃冰箱储存备用。

1．2．2 含药血清制备 将上述制备的四逆散药剂连续给大鼠灌胃7 d（1次／d），对照组给予蒸馏水灌胃。给药剂量为临床成人剂量（即四逆散整方剂量）的10倍量（即整体模型动物的有效剂量），在采血前禁食不禁水12 h以上，末次给药后2 h麻醉，心脏取血，静置30min，离心（2 000 r／min）10min后分离血清，再用0．22μm微孔滤膜除菌，储存于－70℃备用。

1．2．3 四逆散含药血清成分的测定

1．2．3．1 样品的处理 随机从两只大鼠取血清约4 mL，加入20 mL甲醇后快速混匀振荡，密闭超声提取15min，3 000 r／min离心10min，取得上清液后于40℃恒温条件下减压回收，干燥后残渣以1 mL甲醇溶解，0．45μm滤膜过滤，进样分析。

1．2．3．2 色谱条件 Betasil C18色谱柱（4．6 mm× 250 mm，5μm）；流动相A：水，B：乙腈；流速：0．4 mL／min；柱温：35℃；样品室温：4℃；检测波长为210，240，280 nm，进样量20μL；梯度洗脱条件见表1。

1．2．3．3 质谱条件 电喷雾离子源（ESI）；喷雾电压：3．5 kV；负离子检测；鞘气（N2）流速：80 arb；辅助气（N2）流速：5 arb；毛细管温度：300℃；毛细管电压：－30 V。采用全离子扫描方式，扫描范围m／z：100－1 200，碰撞气体为氦气；碰撞室能量：35 V。

1．2．4 细胞培养 将细胞培养于含10%灭活新生牛血清和青霉素、链霉素（各100万U／L）的DMEM培养液中，置于37℃，5%CO2，饱和湿度的培养箱中培养。细胞贴壁生长每2～3天传代1次，取对数生长期细胞用于实验。

1．2．5 CCK-8法检测细胞活力 取对数生长期WB-F344细胞，消化、计数，以4×104／mL的密度接种于96孔培养板中，每孔100μL。培养24 h后，分为正常组和含药血清处理组，分别以5%、10%、20%正常大鼠血清和5%、10%、20%含药血清处理细胞。每个浓度设5个复孔，同时设5个空白调零孔，内加培养液。药物作用48 h后，去上清，每孔加入10μLCCK-8试剂，振荡混匀，继续培养2．5 h，用酶标仪在450 nm处测定光密度值（D）。

1．2．6 葡萄糖消耗量的测定 用6孔板接种WBF344细胞，以10%含药血清作用于WB-F344细胞0、7、14、21 d后，换取新鲜培养基，每孔2 mL，24 h后收集培养基，用血糖仪检测血糖浓度，从而计算细胞消耗的血糖量。取对数期BRL细胞，按上述方法同步进行。

1．2．7 两类肝脏细胞乳酸含量的检测 以10%含药血清作用于WB-F344细胞，分别在第0、7、14、21天，用PBS洗2次，将培养板置于冰上，每孔加入300μL细胞裂解液，充分裂解细胞，裂解后置于Eppendorf管中，4℃12 000×g离心10 min，取上清。按试剂盒说明书操作，最后计算乳酸含量。乳酸含量（mmol／g）＝（测定管D值－空白管D值）／（标准管D值－空白管D值）×标准管浓度÷待测组织样本蛋白含量。取对数期BRL细胞，按上述方法同步进行。

1．2．8荧光素 荧光素酶法测定细胞内ATP含量

接种WB-F344细胞于6孔板，加入10%含药血清，分别于第0、7、14、21天用PBS洗2次，将培养板置于冰上，每孔加入300μL细胞裂解液，充分裂解细胞，裂解后置于Eppendorf管中，4℃12 000×g离心10 min，取上清。取96孔化学发光专用培养板，每孔加入100μL ATP检测试剂，反应2 min，扣除本底后每孔加入相同体积的样本，用化学发光酶标仪检测荧光强度，计算样本中ATP的浓度。测定样本蛋白含量，计算每毫克蛋白ATP的量。取对数期BRL细胞，按上述方法同步进行。

1．2．9 蛋白质印迹法检测肝干细胞受体蛋白的水平 提取经10%含药血清作用0、7、14、21 d的WBF344细胞总蛋白，进行蛋白定量后，样品按比例加入3×SDS凝胶上样缓冲液溶解，煮沸5 min。以20 μg蛋白进行上样，电泳。80 V恒压4 h将蛋白转至PVDF膜。封闭液封闭1 h，一抗孵育4℃过夜，TBST清洗3次，二抗孵育，室温1 h，TBST清洗3次，ECL发光液发光，暗室内X光片感光、显影、定影、观察。检测肝干细胞受体EGFR、FGFR、TGF-βRⅠ、HGFR水平。

1．2．10 统计学方法 采用SAS 9．0统计软件，多组间比较采用单因素方差分析，组间比较采用q检验，数据以均数±标准差（±s）表示，P＜0．05为差异有统计学意义，各实验至少重复3次。

2 结果

2．1 含药血清中四逆散的有效成分

应用HPLC-MS-MS法对血清有效成分进行定性分析，得到（－）ESI-MS的质谱总离子流图，见图1。通过与对照品比对及对碎片离子的分析，经本方法检测出7个化合物原型成分，包括芍药苷、橙皮苷等，同时还检测出部分药物的代谢产物，包括甘草次酸、柚皮素葡萄糖醛酸、橙皮素葡萄糖醛酸等，见表2。

2．2 药物血清对细胞活性的影响

CCK-8检测结果显示，以5%、10%、20%浓度含药血清处理WB-F344细胞48 h后，与对照组比较，四逆散血清均未显示细胞毒性作用。其中，10%含药血清浓度组的细胞活性明显高于对照组细胞活性，差异有统计学意义（q＝6．199，P＜0．05）。见图2。

2．3 药物血清影响细胞葡萄糖的消耗量

如图3所示，随着药物血清作用时间的延长，WB-F344细胞葡萄糖消耗量有降低的趋势，第14、21天与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0．05），至第21天时与BRL组相当，而正常血清处理的WB-F344细胞葡萄糖消耗水平无明显改变。

2．4 四逆散对细胞内乳酸含量的影响

应用乳酸测定试剂盒检测细胞中乳酸的含量，结果显示随着药物血清作用时间的延长，WB-F344细胞中乳酸含量有降低的趋势，与对照组比较，第7天时即有明显差异（P＜0．05），至第14天时细胞中乳酸含量与正常肝细胞乳酸含量相当，而正常血清处理的WB-F344细胞乳酸含量无明显改变。见图4。

2．5 药物血清对细胞ATP水平的影响

药物血清作用于WB-F344细胞后，至第21天时细胞ATP水平比对照组明显升高（q＝16．34，P＜0．05），但与正常肝细胞相比还有差距，对照组的WB-F344细胞ATP水平无明显改变。见图5。

2．6 四逆散对细胞因子受体表达的影响

蛋白质印迹法检测细胞因子受体的表达，结果显示，随着四逆散作用时间的延长，WB-F344细胞EGFR、FGFR、TGF-βR I、HGFR等都有一定的升高，正常血清处理的WB-F344细胞的各细胞因子受体表达无明显改变。见图6。

3 讨论

近年来有文献报道，含中药血清可以诱导干细胞的分化［14－15］，这不仅对细胞移植具有重大意义，而且也阐明了药物治疗疾病新的作用机制。本研究结果显示，给予大鼠四逆散灌胃后，血清中出现的有效成分及代谢物包括芍药苷、橙皮苷、甘草次酸、柚皮素葡萄糖醛酸等。然后我们采用不同浓度的四逆散含药血清作用于WB-F344细胞，以CCK-8法检测细胞活性，显示10%含药血清具有较好的促进细胞增殖的效果，再用10%含药血清处理干细胞，从糖代谢及分子水平上研究四逆散含药血清对肝干细胞分化的影响，并探讨调控分化的机制。

干细胞处于未分化状态时，细胞维持自我更新或增殖状态，细胞糖代谢途径主要为无氧糖酵解［16－17］，这也是细胞维持其干性的一个指标。无氧糖酵解不仅存在于胚胎干细胞，在骨髓、造血及成体干细胞中也有文献报道［18－19］。在一些因素的刺激下，细胞进行分化，能量代谢途径发生改变，细胞耗氧量、ATP水平、糖酵解等代谢相关的酶类都有可能受分化进程的影响产生变化［20－22］。本实验考察了WB-F344细胞的葡萄糖消耗量、乳酸的生成量以及ATP含量这几个指标，并与正常大鼠肝细胞进行对照。结果显示，随着药物血清作用时间的延长，细胞的葡萄糖消耗量、乳酸的生成量有降低趋势，而细胞ATP水平有升高趋势，提示细胞糖代谢水平可能发生改变，药物血清诱导了肝干细胞的分化，但与正常肝细胞相比还有一定差距。

HGF是由728个氨基酸组成的糖蛋白，属于肝源性因子，能刺激肝细胞生长和DNA合成，由间质细胞分泌，并以旁分泌方式作用于邻近细胞［23］。HGF的受体是一种跨膜蛋白，由原癌基因cmet编码，又被称为Met，HGF与受体结合后可以诱导酪氨酸激酶的激活并促进Met的酪氨酸残基磷酸化，进而磷酸化多种相关蛋白，激活多种信号通路而产生不同的生物学效应，如促进细胞分裂、启动肝再生、诱导血管生成、促进细胞迁移、侵袭等［24－26］。EGFR家族包括EGFR、C2erbB22（HER-2）、C2erbB23、C2erbB24四个成员，调控多种细胞间信号和生物学活动。EGFR的配体主要包括TGF-α和EGF，HGF／c-Met和EGFR信号都可调控肝干细胞增生，凋亡，形态形成等［27－28］。FGFR主要包括FGFR1和FGFR2。FGFR1主要在卵圆细胞中表达，FGFR2主要存在于卵圆细胞中，肝星状细胞亦有表达，FGF的乙酰肝素蛋白聚糖能够与跨膜酪氨酸激酶受体结合，在肝干细胞分化的不同阶段发挥作用，刺激来源于所有中胚层和内胚层细胞的增殖，同时具有促进内皮细胞趋化和有丝分裂的作用，也可以影响胚胎肝脏的形成和发育，在肝脏的发育和再生过程中起重要作用［29－31］。TGFβ家族包括TGF-β1，TGF-β2及TGF-β3，其中TGF-β1在体细胞中比例最高、活性最强且分布广泛。TGF-β1与TGF-βRⅡ结合形成复合物，被TGF-βRⅠ识别，进一步被TGF-βRⅡ磷酸化后活化，进而启动细胞下游信号通路［32］。TGF-β是一种调控肝干细胞分化生长的多效因子，一方面促进肝干细胞扩增、分化，另一方面又能诱导肝干细胞凋亡，抑制肝干细胞的过度增殖，以维持肝脏再生后保持其原有的形态与结构，这对肝损伤的修复、防止干细胞突变及肝肿瘤的发生有重要意义［33］。本研究结果显示，四逆散血清作用于WB-F344细胞后，随着作用时间的延长，细胞的EGFR、FGFR、TGF-βRⅠ、HGFR蛋白水平都有增加的趋势，提示四逆散含药血清诱导肝干细胞分化的机制可能与调控这些细胞因子受体的表达有关。

综上所述，四逆散含药血清具有促进肝干细胞增殖分化的作用，能够改变肝干细胞的糖代谢水平，诱导细胞分化，其分化机制可能与调控细胞因子受体体系有关。这为临床应用提供了可靠的理论依据，也为进一步的研究提供了新的思路。

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Effect of drug-containing serum of Si-Ni-San on inducing differentiation of rat′s hepatic stem cells and its regulatory mechanism

XUWei-dong1，QIAN Yuan-xia1，GAO Jing1，ZHAO Ying-qian2
（1．School of Pharmacy，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013；2．Clinical School of Traditional Chinese Medicine，HubeiUniversity of TCM，Wuhan Hubei430065，China）

Objective：To study the effectof drug-containing serum of Si-Ni-San on differentiation of rat′s hepatic stem cells and its mechanism，and explore the scientific basis for treatment of liver disease．M ethods：HPLC-MS-MSmethod was used to detect drug-containing serum of Si-Ni-San；WB-F344 cells were treated with drug-containing serum，the activity of cells was detected by CCK-8 assay，the glucose consumption was assessed by glucometer，generation of lactic acid was determined by LA kit，ATP content wasmeasured by luciferin luciferase method，and the expressions of epidermal growth factor receptor（EGFR），fibroblast growth factor receptor（FGFR），transforming growth factor beta receptor type I（TGF-βRⅠ），hepatocyte growth factor receptor（HGFR）were observed by western blotting．Results：In drug-containing serum of Si-Ni-San，some ingredients in prototype like paeoniflorin and aurantiamarin，others in metabolite type such as naringenin-glucuronic acid and glycyrrhetinic acid．Different concentrations of drugcontaining serum showed no toxic effects on WB-F344 cells after been incubated with drug-containing serum，10%concentration of drug-containing serum could significantly promote proliferation of WB-F344 cells．The levels of glucose consumption and lactic acid decreased with the time of differentiation，but ATP took on a up-regulating trend．the expressions of EGFR，FGFR，TGF-βRI and HGFR also increased as drug-containing serum incubation．Conclusion：The Si-Ni-San containing serum could promote hepaticstem cells′proliferation and induce their differentiation，and maybe the regulatory mechanism is related to cytokine receptors，such as EGFR，HGFR．

Si-Ni-San；hepatic stem cells；glycometabolism；differentiation；cytokine receptors

R285．5

A

1671－7783（2014）05－0369－06

10．13312／j．issn．1671-7783．y140094

国家中医药管理局基础研究基金资助项目（04-05JP39）；江苏大学高级专业人才科研启动基金资助项目（11JDG133）

徐卫东（1971—），男，河南永城人，博士，讲师，主要从事中药复方作用机制研究。

2014－06－11 ［编辑］ 陈海林