LKB1及VEGF-C在鼻咽癌中的表达及意义

2014-04-13程忠强王伟强化龙詹晓东

浙江医学 2014年15期

程忠强王伟强化龙詹晓东

程忠强王伟强化龙詹晓东

目的探讨LKB1及血管内皮生长因子C(VEGF-C)在鼻咽癌中的表达情况及意义。方法选取鼻咽癌患者50例（观察组），另择同期鼻咽黏膜慢性炎症患者50例作为对照组。采用RT-PCR法检测两组患者LKB1及VEGF-C mRNA的表达情况，并分析鼻咽癌组织中LKB1及VEGF-C mRNA的表达与临床病理因素（年龄、淋巴结转移、临床分期、肿瘤大小）的关系。结果观察组患者LKB1 mRNA的表达水平明显低于对照组，VEGF-C mRNA的表达水平明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0．05）。LKB1及VEGF-C mRNA的表达与淋巴结转移及TNM分期明显相关（均P＜0．05），而与年龄及肿瘤大小无明显相关性（均P＞0．05）。鼻咽癌组织中LKB1与VEGF-C的表达呈负相关（r=-0．62，P＜0．05）。结论鼻咽癌组织中LKB1与VEGF-C的表达呈负相关，LKB1的低表达及VEGF-C的高表达可能与鼻咽癌的发生、发展及淋巴结转移有关。

鼻咽癌 LKB1 血管内皮生长因子C

LKB1基因又被称为STKⅡ基因，是一种保守的抑癌基因，在细胞的生长增殖、能量代谢和细胞极性调控等方面起重要作用，且被证明作为抑癌基因与多种肿瘤关系密切。该基因与鼻咽癌的关系至今尚不明确。血管内皮生长因子C（VEGF-C）是肿瘤血管生成的生长因子，能够促进肿瘤细胞的恶性增殖，但能否促进鼻咽癌细胞增殖的研究尚较少。本研究通过联合检测鼻咽癌组织中的LKB1及VEGF-C mRNA的表达情况，旨在探讨LKB1、 VEGF-C在鼻咽癌发生、发展中的作用及相互关系。

1 资料和方法

1.1 一般资料选取2012-06—12我院收治的鼻咽癌患者50例（观察组），均为术中切除标本并经病理证实为鼻咽低分化鳞癌，术前均未接受化疗或放疗。其中男39例，女11例，年龄17～74（59±2.1）岁。对照组为同期收治的鼻咽黏膜慢性炎症患者50例，均为术中切除标本，男37例，女13例，年龄27～71（58±1.8）岁。

1.2 主要仪器及试剂 Applied Biosystems steponel Real-time PCR系统，垂直电泳槽及转膜槽（北京市六一仪器厂），Thermo公司MK3型酶标仪，BIO-RAD gel DOC…XR+成像系统，T-PER组织总蛋白提取试剂盒（Thermoscientific公司），Trizol RNA提取试剂盒（Invitrogen公司），QuantcDNA第1链合成试剂盒和RealMasterMix（SYBRGreen）试剂盒（天根生物科技有限公司），引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

1.3 方法采用Trizol提取两组标本（重约25mg）组织中的总RNA，紫外分光光度计测定RNA的浓度和纯度，0D260/0D280=1.8～2.0，并在1%琼脂糖凝胶电泳中显示出清晰的28S和18S两条rRNA带，证明提取的RNA完整。cDNA合成反应体系含2μg RNA、2μl dNTP混合液（终浓度为0.25μmol/L），2μl Oligo-dTl5（终浓度为1μmol/L），1μl Quant反转录酶，加RNase free ddH2O至终体积为20μl，37℃孵育60min。采用SYBR Green荧光染料，参照试剂盒说明完成RT-PCR。PCR反应体系包括：2.5×Real Master Mix/20×SYBR溶液混合反应液9μl、cDNA溶液2μl、上下引物（终浓度200nmol/L）各2μl，加ddH2O至20μl。LKB1基因PCR反应条件为：95%预变性2min；95℃15s，56℃30s，68℃60s，38个循环；最后95℃15s，降温至56℃1min，然后按每15s上升0.3℃～95℃后保持15s。分别收集荧光信号，进行熔解曲线分析。GAPDH基因PCR反应条件为：95℃预变性2min；95℃15s，63℃30s，68℃60s，40个循环；最后95℃15s，降温至60℃1min，然后按每15s上升0.3℃～95℃后保持15s。VEGF-C退火温度为54.8℃，延伸72℃45s，进行32个循环，最后72℃延伸10min。分别收集荧光信号，进行熔解曲线分析。结果采用相对定量法计算，基因引物序列、退火温度见表1。所有PCR扩增产物片段用琼脂糖凝胶电泳后，采用全自动电泳凝胶成像分析仪取图，基因表达者出现相应长度的扩增条带，减弱者则条带变细或变淡，缺失者则无特异性扩增条带出现。用Gel-pro Analyzer 4.5凝胶定量分析软件分析各扩增条带产物的含量。内参GAPDHmRNA在各种组织中表达稳定，取目的基因条带与内参条带光密度值的比值作为目的基因的相对值。

1.4 统计学处理采用SPSS19.0统计软件，所得计量资料以表示，两样本均数比较采用t检验，多样本均数比较采用方差分析，相关关系采用Pearson相关分析。

表1 引物序列及退火温度

2 结果

2.1 两组标本组织中LKB1及VEGF-C mRNA表达情况的比较见表2。

表2 两组标本组织中LKB1及VEGF-C mRNA表达情况的比较

由表2可见，观察组患者LKB1 mRNA的表达水平明显低于对照组，VEGF-C mRNA的表达水平明显高于对照组，差异均有统计学意义（均P＜0.05）。

2.2 鼻咽癌组织中LKB1及VEGF-C mRNA的表达与临床病理因素的关系见表3。

由表3可见，LKB1及VEGF-C mRNA的表达与淋巴结转移及TNM分期明显相关（均P＜0.05），而与年龄及肿瘤大小无明显相关性（均P＞0.05）。

2.3 鼻咽癌组织中LKB1与VEGF-C表达的相关性鼻咽癌组织中LKB1与VEGF-C的表达呈负相关（r=-0.62，P＜0.05）。

3 讨论

1998年，芬兰学者Hemminki等[1]和德国学者Jenne等[2]成功克隆Peutz-Jeghers综合征的致病基因，分别命名为LKB1和STKⅡ。LKB1定位于19P13.3，DNA全长2158bp，编码区1302bp，包括9个外显子、1个非编码外显子和11个内含子，其编码的LKB1蛋白由433个氨基酸组成，相对分子质量为60kDa，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。其第44～309位氨基酸为激酶催化区，N端第38～43位氨基酸残基是核定位信号序列。Rowan研究表明，人体中几乎所有的组织均有LKB1 mRNA的表达。本研究结果显示，观察组LKB1的表达水平显著低于对照组，VEGF-C mRNA的表达水平明显高于对照组；而且鼻咽癌组织LKB1 mRNA和VEGF-CmRNA的表达呈负相关。

目前，LKB1/VEGF-C参与喉肿瘤发生的机制尚未完全清楚，但在肿瘤组织中LKB1的缺失/突变表达使其正常生物学功能丧失可能是鼻咽癌的发生机制之一。丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶是一类在细胞内广泛分布的蛋白质，其在细胞的多种生命活动中起着非常重要的作用，LKB1的生物学功能主要有：（1）使细胞周期阻滞在G1期、促进细胞凋亡[4-5]，LKB1与p53靶基因p21/WAF1的关系密切，使其在肿瘤细胞凋亡发生机制上起重要作用；（2）（VEGF-C的表达，LKB1下调VEGF-C的表达，抑制肿瘤细胞VEGF-C的信号转导，从而抑制肿瘤细胞的增殖及转移。LKB1抑制肿瘤分子机制如下：（1）LKB1基因能促进腺癌细胞进入凋亡程序：LKB1可以激活p53靶基因p21/WAF1。LKB1可以稳定体内p53，与p21/ WAF1激活过程密切相关。研究先后发现，抑癌基因LKB1可在细胞核内与p53基因发生物理性交联，直接或者间接使p53的两个基因残基Ser15和Ser392磷酸化[6]，而且这两个残基对于LKB1依赖性细胞周期G1期停留是必需的。研究还发现，LKB1直接参加p21/WAF1启动过程，以及其它p53的激活启动，将LKB1基因融合到缺陷型p53（激活位点被敲除）可以提高p21/WAF1的激活。这都说明LKB1确实是在p21/WAF1基因激活过程中扮演着直接作用，通过促进癌细胞进入凋亡程序来抑制癌细胞的增殖。（2）LKB1基因对肿瘤细胞VEGF的负调控[7]：在研究肺腺状细胞癌变分化过程中发现，LKB1可下调VEGF的表达，抑制肿瘤细胞VEGF的信号通路的转导。VEGF基因的近端富含GC序列，是转录因子SP1的顺式作用原件，激活的SP1能加强VEGF的生成和表达，且LKB1具有丝-苏氨酸激酶活性，SP1又是其磷酸化的底物，缺失/突变的LKB1使得SP1磷酸化的转录活性增强。应用巢式PCR方法[8]，扩增LKB1基因编码区、构建LKB1真核表达载体检测LKB1在腺癌细胞中的表达以及siRNA技术干扰SP1的表达，结果显示：SP1参与LKB1基因对VEGF-C的表达调控，证实了LKB1通过负调控转录因子SP1的表达来调控VEGF的表达[9-12]。

本研究结果显示，LKB1和VEGF-C在鼻咽癌中的表达呈相反趋势，LKB1的低表达、VEGF-C的高表达可能与鼻咽癌的肿瘤细胞发生、发展及肿瘤的淋巴结转移有关，下一步可以通过质粒转染方法揭示两者与肿瘤细胞发生、发展的内在联系，LKB1和VEGF-C有望成为鼻咽癌患者诊断和治疗新的评估指标，达到与监测鼻咽癌EB病毒抗体来判断患者病情的同样效果。如果能够抑制LKB1的突变，维护其正常生物学功能，促使凋亡程序正常，有望在一定程度上阻止鼻咽癌的发生和发展，为研制抗肿瘤新药提供新的有效的分子靶标。

表3 鼻咽癌组织中LKBl及VEGF-C mRNA的表达与临床病理因素的关系

[1]Hemminki A,Markie D,Tomlinson I,et al．A serine/threonine kinase gene defective in Peutz-Jeghers syndrome[J]．Nature,1998,391 (6663)：184-187．

[2]Paavonen K,Horelli-Kuitunen N,Chilov D,et al．Novel human vascular endothelial growth factor genes VEGF-B and VEGF-C localize to chromosomes 11q13 and 4q34 respectively[J]．Circulation,1996,93(6)：1079-1082．

[3]Jenne D E，Rammann H．Peutz-jeghers syndrome is caused by mutations in a novel serine threonine kinase[J]．Nature Genetics, 1998,18(1)：38-43．

[4]葛明珠,崔涛．抑癌基因LKB1在胃癌组织表达及意义[J]．齐鲁医学杂志,2010,4(25)：312-314．

[5]Zeng Pingyao,Berger S L．LKB1 is recruited to the p21/WAF1 promoter by p53 to mediate transcription alactivation[J]．Cancer Res,2006,15(22)：10701-10708．

[6] 黄蓓,任艳敏,魏皓,等．LKB1基因Thr336磷酸化多克隆抗体制备方法及在肿瘤发生中检测的应用[J]．中国生物制品杂志,2009,21(11)：995-999．

[7]王国臣,李作生．LKB1和VEGFR2评价肺腺癌预后的意义[J]．临床肺科杂志,2013,18(6)：1096-1097．

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[11] 庄志刚,蒋蓓琦．LKB1基因沉默对乳腺癌细胞生物学行为的影响[J]．同济大学学报,2010,31(6)：11-14．

[12]李爱玲,柏兴华．LKB1在子宫内膜样腺癌中的表达及意义[J]．中国医科大学学报,2013,42(3)：221-224

Expression of LKB1 and VEGF-C in nasopharyngeal carcinoma and their clinicopathological significance

Objective To investigate the expression of LKB1 and VEGF-C in nasopharyngeal carcinoma and their clinicopathological significance．MethodsTissue specimens were collected from 50 patients with nasopharyngeal carcinoma(NPC group)and 50 patients with chronic inflammation of nasopharyngeal mucosa(control group)．The expression of LKB1 and VEGF-C mRNA in nasopharyngeal tissue was detected by RT-PCR and the correlation of LKB1 and VEGF-C expression with clinicopathological factors in NPC patients was analyzed．ResultsThe expression level of LKB1 mRNA was significantly lower and the expression of VEGF-C mRNA was significantly higher than those in control group(P＜0．05)．The expression of LKB1 and VEGF-C mRNA was significantly correlated with lymph node metastasis and TNM stage(P＜0．05),not correlated with age and tumor size of the patients(P＞0．05)．LKB1 expression was negatively correlated with VEGF-C in NPC patients(r=-0．62,P＜0．05)．ConclusionLKB1 and VEGF-C are abnormally expressed in nasopharyngeal tissue of NPC patients,suggesting that they may be associated with the development and lymph node metastasis of nasopharyngeal carcinoma．

Nasopharyngealcarcinoma LKB1 VEGF-C