功能性人工窖泥培养配方筛选研究

2014-04-12姚万春唐玉明任道群刘茂柯田新惠

中国酿造 2014年8期

姚万春，唐玉明，任道群，刘茂柯，田新惠，刘淼

（1.四川省农科院水稻高粱研究所，四川泸州 646000；2.泸州老窖股份有限公司，四川泸州 646000）

自古以来，窖池都是浓香型大曲酒生产的主要设备。要产好酒，就必须有好的窖池，而好的窖池其本质在于优质的窖泥[1]。窖泥质量不仅在于其理化指标丰富程度，更取决于其中有益窖泥功能菌的种类、数量及产物的代谢能力，以及营养成分的合理比例[2]。正是由于这些有益功能菌的大量生长、繁殖、代谢以及相互协调作用，才赋予了白酒的独特香型，造就了以己酸乙酯为主体香的浓香型白酒的典型风格[3-4]。因此，窖泥质量的优劣对浓香型白酒的质量起着至关重要的作用。但是传统人工窖泥在生产过程中有两个突出问题：新窖泥自然老熟时间太长；使用一段时间后窖泥会老化而影响酒的品质[5-6]。而在传统人工窖泥培养的基础上，通过采取加入协调而全面的优良菌种、科学合理的培养配方及认真细致的生产管理等措施培养功能性人工窖泥，增大窖泥中有益微生物菌群和各种营养成分，并加速其老熟，以缩短自然老熟时间，使浓香型白酒的生产特别是优品率稳定在一个较高的水平，提高白酒企业的经济效益[7-10]。

本研究遵循窖泥功能菌生存的自然环境条件，应用微生物营养、培养基成分调节理论，通过窖泥成分调控，培养出不同配方的功能性人工窖泥。通过对窖泥的感官鉴定以及理化、微生物指标的对比研究，判断窖泥的老熟情况，初步筛选出功能性人工窖泥最适宜的培养配方，为其产业化提供可靠的科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 窖泥培养原料

基础泥：选用泸州当地氮（N）、磷（P）、钾（K）含量丰富，比例协调，且pH值适中的菜地黄泥土（要求土质细腻绵软、微酸性、无夹沙、无污染，须晒干破碎）；老窖泥、窖皮泥、酒糟、黄浆水：来自泸州老窖酒厂（老窖泥要求窖龄长、酒质好的池中色泽灰褐、柔软细腻、酯香突出的优质窖泥；窖皮泥、酒糟、黄浆水来源于正常发酵的窖池）；豆饼粉：市购（要求无霉变、无蛀虫、无异味）；大曲粉：泸州老窖大曲生产厂；混合盐、乙酸钠（化学纯）：成都科龙试剂公司，铵盐、磷酸盐、镁盐按5∶4∶2的比例混合成混合盐；复合功能菌液：本实验室培养（黄褐色悬挂液体，闻有己酯香味，微酸，发酵旺盛）；气相色谱所用试剂均为市售色谱纯。

1.1.2 复合功能菌液种源

泸州市酿酒科学研究所从400年老窖池中筛选的窖泥功能菌株（己酸菌）与优质老窖泥混合培养。

1.2 仪器与设备

DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司；HHS-21-8电热恒温水浴锅：上海搏迅实业有限公司医疗器械厂；7230 G可见分光光度计：上海精密科学仪器有限公司；DRP-9082电热恒温培养箱：上海森信实验仪器有限公司：HD-1360型超净工作台：哈尔滨市东联电子技术开发有限公司；LDZX-50KBS型高压蒸汽灭菌锅：上海申安医疗器械厂；Agilent6820气相色谱仪：美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 窖泥菌体数检测方法

稀释平板计数法[11]。

1.3.2 窖泥理化指标测定[12]

水分-烘干法；pH值-电位法；腐殖质-重铬酸钾氧化法；氨基酸态氮-半微量开氏法；有效磷-分光光度法。

1.3.3 气相色谱法测定窖泥的微量成分测定[13]

窖泥中微量成分的提取：准确称取10 g窖泥→加50 mL无水乙醇→冰浴研磨后密封→浸取12 h→倒出上清液→再加50 mL体积分数为65%乙醇→冰浴研磨后密封→浸取12 h→将两次浸取液混匀→5 000 r/min冷冻离心15 min→上清液用微孔滤膜过滤→滤液用于色谱分析。

气相色谱分析条件：使用高纯氮气为载体，流速1.8 mL/min，尾吹气约30 mL/min。初始柱温40 ℃，保持4 min，以5 ℃/min升温至120 ℃，保持15 min，再以10 ℃/min升温至230 ℃，保持10 min。进样口温度为230 ℃，检测器温度为240 ℃。

1.3.4 配方原则

通过对窖泥理化与微量成分及其微生物的生活习性研究，从优质窖泥中广泛筛选优良有益菌，并诱变选育出优良窖泥功能菌。采用纯功能菌与老窖泥混合培养的复合功能菌液为种源，选择适宜的基础泥，模拟老窖泥中有益菌的生长条件添加辅料与营养物质，以满足窖泥功能菌生长、繁殖及次生代谢对养分、水分等环境条件需求。从有利于富集窖泥有益微生物所需的水分、pH值、碳、氮、磷、钾等因素综合考虑，使有益微生物在良好环境条件下生长繁殖，从而使窖泥尽快达到老熟[14]。

1.3.5 配方设计

上述原料根据不同组合和比例进行正交试验，从试验结果中选出较为理想的5种配方继续扩大培养试验，其配方设计见表1。

1.3.6 培养方法

窖泥培养方法要模拟窖内微生物的生存环境条件，遵循老窖自然形成规律，选择一条科学合理的生态路线[15]。不论采用什么配方，都要精心操作，细心管理，才能达到培养优质窖泥的目的。功能性人工窖泥培养采用两次发酵法，即将固体、液体物料和菌液混合均匀堆积发酵14 d后取样检测，根据检测结果适当补充水分，混合均匀后再入池发酵，35 ℃恒温培养60 d。

表1 各配方辅料占基础泥的比例Table 1 Proportion of auxiliary material in different formulations by basic mud%

2 结果与分析

按照1.3配方和方法制作功能性人工窖泥，35 ℃恒温培养60 d后进行窖泥感官鉴定及理化、微生物指标与微量成分分析检测。

2.1 不同配方功能性人工窖泥中厌氧功能菌数量测定

功能性人工窖泥培养没有盲目添加窖泥微生物营养需要的水果、粮食原料等，而是主要利用黄水、酒尾、糟醅等酿酒废料，以便富集和驯化窖泥中的有益微生物。对不同配方功能性人工窖泥中厌氧功能菌数量进行测定，其结果见表2。

厌氧菌是窖泥中的有益功能菌群，其数量决定着窖泥质量。由表2可知，由于所有配方窖泥中都加入了以己酸菌为主的复合窖泥功能菌液，所以各配方的厌氧功能菌均以己酸菌为主。配方1的厌氧功能菌数量比其他配方少，特别是硫酸盐还原菌和硝酸盐还原菌；己酸菌、丁酸菌、甲烷菌及厌氧功能菌总数均是配方4和配方5接近，配方2和配方3接近，前者多于后者。窖皮泥分析原因可能是由于配方1中没添加窖皮泥，导致其菌种种源少。说明培养人工窖泥时，在对酸度予以调整的前提下，尽可能加大黄水的用量，充分利用黄水中含有大量营养物质和窖泥微生物的有利条件；加入适量的黄水、酒糟、豆饼粉和酒尾营养物质后，可以不必加入乙酸钠；添加优质窖皮泥会丰富人工窖泥的种源。

2.2 不同配方功能性人工窖泥理化指标检测分析

对不同配方功能性人工窖泥的理化指标进行检测，其结果见表3。

一般认为成熟窖泥的水分含量介于38%～45%之间[16]。由表3可知，以上配方窖泥样品的水分含量差异不大，均属于正常范围。上述各配方窖泥pH值在5.5～6.7之间，与己酸菌生长的适宜范围pH 5.8～6.8[17]基本接近，配方4和配方5中由于添加的黄水比例比其余配方大，使其窖泥pH值要偏低些，但仍在己酸菌产己酸要求的pH值5～7[18]的范围内。各配方氨基酸态氮、有效磷、腐殖质含量比较：配方1没有添加窖皮泥和乙酸钠，腐殖质含量最低，氨基酸态氮和有效磷含量较低；配方2没有添加营养盐和乙酸钠，氨基酸态氮和有效磷的含量最低，腐殖质含量较低；配方3没有添加乙酸钠，氨基酸态氮、有效磷、腐殖质含量都居中；配方4没有添加乙酸钠，但添加的黄水较多，氨基酸态氮含量最高，有效磷和腐殖质含量高于配方3低于配方5；配方5不但添加的黄水较多，还添加了乙酸钠，氨基酸态氮含量与配方4接近，有效磷和腐殖质含量最高。

窖泥中腐殖质是土壤中各种营养元素，特别是碳（C）、氮（N）、磷（P）的重要来源，是土壤微生物生物活动的产物，它可以全面反映窖泥对微生物的营养供应[19]；氨基酸态氮、有效磷是窖泥微生物生长、繁殖所必需的速效元素，无疑对窖泥功能菌的富集和驯化起到积极的促进作用[20]；据前人研究，老窖泥中的总酸总酯含量高于人工窖泥，它们含量高低可以判断窖泥优劣。

2.3 不同配方功能性人工窖泥的感官鉴定

窖泥质量判定标准由两部分组成，一是理化和微生物分析检测，二是感官鉴定。以感官鉴定为主，理化微生物数据为基本要求[21]。培养成熟的不同配方功能性人工窖泥，其质量经专家鉴定，结果见表4。

表4 不同配方功能性人工窖泥的感官鉴定Table 4 Sensory evaluation of man-made pit mud with different formula

由表4可知，本次试验选用的5个配方培养的功能性人工窖泥感官总体看来均可，但从色泽、气味、手感几个方面综合考虑，配方5香气更纯正，酯香和窖香味更浓烈。因此，配方5培养的人工窖泥老熟程度最好，更适合用于浓香型白酒生产。

2.4 不同配方功能性人工窖泥的微量成分检测

长期以来，人们对窖泥质量的判别主要是依靠感官鉴定和一些理化分析数据，如色泽、手感、气味、水分、腐殖质、氨基酸态氮、有效磷和芽孢菌数等指标来衡量窖泥的优劣[22]。目前，生产上尚未发现一种有效判定窖泥质量好坏的指标体系，窖泥感官的评价能否上升到微量成分的检测评价，这值得酿酒研究工作者进一步探索和研究。为此，本研究在对窖泥感官鉴定及理化、微生物分析的同时，还结合窖泥的微量成分进行比较分析。不同配方功能性人工窖泥的微量成分检测结果见表5。

由表5可知，各类微量成分在配方间的差异，酯类化合物最大，其次是酸类化合物，醛类和醇类化合物在配方间的差异均不明显。总微量成分在配方间有差异，其种类的差异大于含量的差异。配方4和配方5的总酯种类及含量最多，种类分别为5种、6种，含量分别为0.198 9 g/100 g、0.221 9 g/100 g；配方4和配方5总酸种类及含量最多，种类均为7种，含量分别为2.652 5 g/100 g、2.728 1 g/100 g；配方4和配方5总微量成分种类及含量最多，种类分别为16种、17种，含量分别为3.334 g/100 g、3.384 9 g/100 g；配方4和配方5总酸、总酯、总微量成分含量均高于其他配方。

据前人研究，老窖泥中的总酸总酯含量高于人工窖泥，它们的含量高低可以判断窖泥优劣。由此判断，配方4和配方5的窖泥质量优于其他配方。再根据总酯、总酸、己酸、己酸乙酯含量与总微量成分含量及其种类判断，二者之中添加乙酸钠的配方5最优。由此可以初步推断，培养人工窖泥时添加适量的乙酸钠是十分必要的。