芫花-甘草配伍对雌性小鼠肝损伤的实验研究

王松原, 魏玉辉, 张国强, 武新安*

（1.兰州大学第一医院药剂科, 甘肃 兰州 730000； 2.兰州大学药学院, 甘肃 兰州 730000）

芫花-甘草配伍对雌性小鼠肝损伤的实验研究

王松原1,2, 魏玉辉1, 张国强1, 武新安1*

（1.兰州大学第一医院药剂科, 甘肃 兰州 730000； 2.兰州大学药学院, 甘肃 兰州 730000）

目的 观察不同比例的甘草、 芫花合用后对小鼠肝细胞膜转运体 Na+-牛磺酸钠共转运体 （ Na+/taurocholate cotransporting polypeptide， Ntcp） 表达的影响， 并探讨芫花-甘草配伍后所致肝损伤的可能机制。 方法 昆明种雌性小 鼠35 只， 随机分为 5 组， 分别灌胃给予生理盐水、 芫花水煎液、 甘草水煎液、 芫花-甘草 （1 ∶1） 混合煎煮药液、 芫花-甘草 （1 ∶3） 混合煎煮药液。 于给药 7 d 后， 取小鼠肝脏组织， 用 Western bloting法考察肝细胞膜 Ntcp 的表达， 用酶循环法检测肝细胞内总胆酸盐的水平， 用苏木精-伊红染色法 （ hematoxylin-eosin staining， HE法） 研究肝脏组织病理学变化， 将所得数据通过统计软件计算相关度。 结果 芫花-甘草配伍组肝细胞膜上 Ntcp 表达量与单位质量肝组织内胆汁酸盐 （ Total bile acid， TBA） 显著上升 （ P＜0.05） 并伴有肝损害;Ntcp 表达量与单位质量肝组织内 TBA的水平呈显著正相关 （r=0.963）， 与肝脏病理损害程度正相关 （ r=0.947）。 结论 芫花-甘草配伍后可显著升高小鼠肝细胞膜 Ntcp 表达， 引起 TBA肝内蓄积， 可能是导致雌性小鼠肝损害的原因之一。

配伍禁忌; 芫花; 甘草; 免疫印迹;Ntcp

传统医学将两味中药合用后产生毒性或使原有毒性增加的现象， 称为 “相反” 作用［1］。 “十八反” 是中药十八对配伍禁忌的总称， 源自 《神农本草经》 并被历代重要本草引用。“十八反” 常见的毒性之一是肝毒性， 而胆汁酸盐在肝内蓄积是药物导致肝毒性的常见形式［2］。 钠离子 /牛磺胆酸 共 转 运 蛋 白 （ Na+/taurocholate Cotransporting Polypeptide， Ntcp） 表达于肝细 胞 膜 上， 负 责 将 胆 汁 酸盐从血液转入细胞，其表达或功能变化均可影响胆汁酸盐的转运。

中药配伍禁忌在临床上倍受重视，但出于某些特定的治疗用途，从古至今一直有将相反药物配伍使用的方剂。芫花配伍甘草属于十八反之一，有报道指出该配伍迄今临床上仍短期大剂量用于堕胎等［3］。 研究证实甘草与芫花合用后对大鼠心、肝、肾脏组织有不同程度损害，以其所致的药物性肝损伤尤为常见［4］。 为此， 本实验拟通过研究芫花-甘草配伍给药后对小鼠肝脏 Ntcp 表达的影响， 从转运体角度阐明其肝损害机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器 OLYMPUSAU400 全自动生化分析仪 （日本 OLYMPUS 光学株 式 会 社） ; 离 心 机 （ Allegra 64R Centrifuge BECKMAN COULTER）;DYCZ-24DN型电泳仪 （北京六一仪器厂）;DYCZ-40D转膜仪 （ 北京六一仪器厂）; 低温高速离心机 （ 美国 Thermo公司） ;PVDF转移膜 （ GE Healthcare， 0.45 μm）;X线胶片 （型号:XBT-1， 日本 Kodak 公司） ; 电泳凝胶 成 像 分 析 系 统 Image Quant350 （ GE Healthcare）;LT-224S 电子天平 （ Sartorios BS400S） ; 微量进样器（宁波市镇海三爱仪器厂）; 水平摇床 （ 型号 WD-9405B，北京六一实验仪器厂）。

1.2 试剂 芫花产自四川省德阳市， 甘草产自宁夏灵武市美康甘草基地，由甘肃省食品药品监督检验所宋平顺教授鉴定， 分别为瑞香科植物芫花 Daphne genkwa Sied.et Zucc.的干燥花蕾和豆科植物甘草 Clycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根及根茎，标本收藏于兰州大学第一医院药剂科实验室样品室。

PVDF膜 （ 美国 GE Healthcare公司， 0.45 μm） ;Rabbit polyclonal to SLC10A1 （ 美 国 Abcam 公 司， 批 号ab85611） ; β-actin 抗体 （ 武汉 博 士 的 生 物 工 程 有限 公 司，批号 BA2305）; 二抗山羊抗兔 IgG/辣根酶标记 （北京中杉金桥生物技术有限公司， 批号 98609）;PMSF（上海碧云天生物技术有限公司， 产品编号 ST506-2）;RIPA裂解液（上海碧云天生物技术有限公司， 产品编号 P0013B）; 定影液，显影液购自天津市南开区成信医用辅助材料厂。

2 试验方法

2.1 供试品制备 根据陈艳琰等的研究［5］， 提取方法采用: 甘草称定质量后加入 15 倍量的蒸馏水， 浸泡 90 min 后煎煮， 以煮沸后 60 min 作为提取时间， 煮好药液冷却后用布氏漏斗过滤， 再将提取液用蒸发皿浓缩至1 mL（相当于原生药 0.375 g）， 即为甘草水煎液。 芫花水煎液制备同上，质量浓度也为 0.375 g/m L。 芫花-甘草合煎液为生药按 1 ∶1和1∶3称定质量后混合， 其余制备方法同上， 药物总生药量为 0.375 g/m L。 即为小鼠 1 ∶1 灌胃水煎液和小鼠 1 ∶3灌胃水煎液。4℃储藏备用。

2.2 实验动物的分组及给药 雌性昆明种小鼠 35 只， 体质量 20 ～22 g， 购于兰州大学动物实验中心， 合格证号SCXK （甘） 2004-0006。 根据于大猛等的研究芫花-甘草临床常用剂量为 1 ∶1， 另根据陈艳琰等的研究芫花-甘草 1 ∶3时合煎液毒 性 成分总溶 出 率 最高［3，5］。 同时根 据 生 药总量不变原则。小鼠随机分成5组:对照组、芫花组、甘草组、芫花-甘草 1 ∶1 合用组和芫花-甘草 1 ∶3 合用组， 每组 7只。各组分别灌胃给予生理盐水、芫花水煎液、甘草水煎液、 小鼠 1 ∶1 灌胃水煎液和小鼠 1 ∶3 灌胃水煎液 15 g/（kg·d）。 于灌胃 7 d 后处死， 取其肝脏组织。

2.3 病理检查 小鼠肝脏置于 10%甲醛溶液固定 24 h 后，经乙醇脱水、二甲苯透明、 石蜡包埋、 切片、 HE染色、 光学树脂封片，于光学显微镜下观察肝脏组织病理形态学变化。

2.4 蛋白免疫印迹 取小鼠肝脏 0.04 g， 液氮研磨后加入RIPA裂解液提取蛋白。 将处理好样品用 10%SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳分离， 电转移至 PVDF膜上。 含 5%脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭 1 h， 分别加入 Ntcp （1 ∶3 000） ， β-actin（1 ∶3 000） 一抗， 4℃孵育过夜， 分别加入二抗山羊抗兔IgG （1 ∶3 000）， 室温摇床上孵育 90 min， ECL化学发光法发光显迹，经化学方法显影定影。

化 学 发 光 显 色 的 western blotting结 果 经 GE Image Quant350 电泳凝胶成像分析系统扫描后， 用 ImageJ 1.34 版本进行光密度分析，密度分析结果经内参蛋白校正，考察目标蛋白相对含有量的变化。

2.5 肝组织胆汁酸盐 （TBA） 检测 取肝组织 100mg， 剪碎， 加入 1 mL 75%乙醇溶液， 用组织匀浆器匀浆， 肝匀浆液 50 ℃孵育 2 h 后， 6 000 ×g 离心 10 min， 取上清 0.05 mL， 备用。 按照胆汁酸酶循环法检测试剂盒操作标准测定样品 TBA水平。

2.6 统 计 学 处 理 利 用 SPSS 19.0 for Windows XP统 计 软件， 计量资料采用表示。 对小鼠肝脏病理分级组间比较采用 Ridit分析， 其余同一指标组间比较采用 t检验; 两指标间关系采用 Spearrman 秩相关分析， 检验水准α=0.05。

3 结果

3.1 肝脏转运体 Ntcp 的表达 肝细胞膜转运体 Ntcp 的表达见图 1。 与对照组相比， 芫花和甘草合用组 Ntcp 的 表达均有明显升高 （P＜0.05）， 其中芫花-甘草 （1 ∶1） 合用组显著上升 （P＜0.01） 。 单给芫花和甘草对 Ntcp 的表达无显著影响 （P＞0.1）。

3.2 肝组织病理检查 各组小鼠灌胃给药后肝组织病理变化见图 2。 对照组 （ 图 2A） 肝组织结构清晰， 肝细胞形态正常; 芫花组 （图2B） 部分肝细胞羽毛状变性， 坏死及肝窦扩张; 甘草组 （ 图 2C） 少量肝细胞水肿; 芫 花-甘草（1 ∶1） 合用组 （ 图 2D） 肝细胞弥漫水肿， 气 球样变 及颗粒样变，散在点灶状肝细胞坏死，炎症细胞浸润，散在肝细胞嗜酸变。 芫花-甘草 1 ∶3 合用组 （图 2E） 肝细胞弥漫水肿，气球样变，被膜下肝细胞弥漫羽毛状变性，散在肝细胞嗜酸变，散在肝细胞坏死，炎症细胞浸润。

图 1 肝细胞膜转运体 Ntcp的表达 （n=7）

参考王明宇的方法［6］， 根据实验各组肝组织变性情况的不同， 分为4级， “-” 肝细胞形态和组织正常， “+”肝细胞水肿，未见肝细胞坏死，“++”少许肝细胞坏死，炎细胞浸润。 “+++” 为点灶状肝细胞坏死，炎细胞浸润，细胞嗜酸变。

根据各组小鼠肝组织变性情况进行半定量分析，结果表明，对照组肝脏结构基本正常;单用甘草组对肝细胞无明显影响; 单用芫花组对肝细胞有损伤; 芫花-甘草 （1 ∶1） 合用后对细胞损伤明显增加; 芫花-甘草 （1 ∶3） 合用后比（1 ∶1） 合用对细胞危害相对减轻。 经 Ridit分析， 各组间病理损害程度有显著的差异 （P＜0.05）， 见表 1。

图 2 各组小鼠灌胃给药 7 d后肝组织病理变化图 （ ×400 HE）

表1 小鼠肝脏组织变性半定量分析结果

3.3 肝组织 TBA水平检测 各组肝细胞 TBA积累量见图3。 与对照组相比， 除甘草组轻微下降外 （P＞0.1）， 各组均有上升。 其中芫花组与芫花-甘草 （1 ∶1） 合用组有显著上升 （P＜0.05）。 芫花-甘草 （1 ∶3） 合用组也有轻微上升，但因为个体差异过大，而与对照组没有显著性差异。结果表明甘草能够轻度降低 TBA在肝细胞内的蓄积， 而芫花则相反， 可以增加肝细胞内 TBA的水平。 甘草和芫花合用后， 肝细胞内胆汁酸水平大幅上升， 造成严重的 TBA蓄积。 初步分析认为: 芫花-甘草 （1 ∶1） 合用后， 与其他各组相比， Ntcp 上升与 TBA蓄积现象明显加重。 病理检查结果也证明， TBA蓄积严重的小鼠其肝损害也较重 （见表2）。 由于甘草降低 Ntcp 和 TBA的肝保护作用， 芫花-甘草（1 ∶3） 合用时， 肝损害较 （1 ∶1） 组轻。 如芫花-甘草（1 ∶1） 合用组肝细胞水肿及细胞坏死遍布全肝， 芫花-甘草 （1 ∶3） 组仅限于血管周围; 芫花-甘草 （1 ∶1） 组胆小管增生较芫花-甘草 1 ∶3 组明显加重。

3.4 相关分析 Ntcp 值 为 曝光所得 Ntcp 蛋白 光 密 度值经内参蛋白矫正后的样品平均值 （见表 2）。 TBA值为单位质量肝脏组织内 TBA水平。 经相关分析结果显示， 在双侧置信度为 0.05 时， Ntcp 与 TBA为显著正相关 （ r=0.963，P=0.037）， 与 病 理 损 害 程度正 相 关 （ r=0.947， P= 0.053）， 病理分级与 TBA无显著相关性 （r=0.827， P=0.173）。 这说明小鼠肝脏内 Ntcp 的上升与 TBA的蓄积以及肝脏的病理损害存在直接联系。

图3 肝细胞 TBA积累量

表 2 不同病理 分 级下小鼠 N tcp值 与 TBA （， n=7）

表 2 不同病理 分 级下小鼠 N tcp值 与 TBA （， n=7）

病 理分级 动 物数 Ntcp 表 达 TBA/（ μmol·L-1）-8 0.56 ±0.17 30.05 ±4.92 + 10 0.64 ±0.17 32.15 ±4.61 ++ 8 0.72 ±0.22 32.21 ±10.51 +++ 9 0.99 ±0.31 51.02 ±10.43

4 讨论

研究结果表明，单独给予小鼠芫花或甘草水煎剂后，与对照组相比， 芫花对小鼠肝脏 Ntcp 表达有诱导作用， 甘草则为抑制作用， 但均未见明显的肝损伤。 给予芫花-甘草不同比例 （1 ∶1、 1 ∶3） 合煎剂后均可造成明显的肝损伤，其中以芫花甘草1∶1组最为严重。

Ntcp 转运体表达于肝细胞膜上， 负责将 TBA从血液摄入肝细胞。 TBA是胆汁的主要成分之一， 在肝脏中大部分以有机阴 离子形式 存 在， 对 肝细胞具 有 一定毒性［7-10］。 随着肝细胞内 TBA水平的增加， 肝细胞会逐渐发生病理变化直至凋亡［11-13］。 本实验中， 甘草-芫花配伍用药后， 随芫花比例升高， Ntcp 值与 TBA值同步升高， 致使肝损害程度增加。 当芫花甘草比例为 1 ∶1 时， 肝脏 Ntcp 表达升高最为显著 （0.99 ±0.31）， 肝 细 胞 内 TBA的 蓄 积 也最 为 严 重（51.02 ±10.43 ） μmol/L。 由此可见， 芫 花-甘草配伍 后，随芫花比例的升高， 肝脏 Ntcp 的表达随之升高， 从而导致肝细胞内 TBA的过量蓄积， 可能是造成小鼠肝损伤的主要原因之一。

芫花-甘草配伍影响小鼠肝细胞 Ntcp 表达的具体机制尚不清楚。 有报道指出， 当肝细胞内 TBA升高或肝脏出现病理损害时，肝细胞核内的法尼酯衍生物 x受体将被激活，通过其信号通路影响下游基因转录与翻译， 抑制 Ntcp 表达以促进 TBA转运［14］。 但是， 这一现象在本实验中并不明显。 芫花-甘草配伍是否通过干扰该信号通路来影响 Ntcp 表达，有必要对其调控机制进行更深入的研究。此外，肝细胞中负责胆酸盐外排的 BSEP转运体的变化尚待进一步研究。

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R285.5

:B

1001-1528（2014）12-2605-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.037

2013-09-16

王松原 （1987—）， 女， 硕士研究生， 研究方向: 临床药学。 Tel:18293154230， E-mail:w.songyuan@gmail.com

*通信作者: 武新安 （1962—）， 男， 教授， 博士生导师， 研究方向: 药物间的相互作用与转运体的关系。 Tel: （0931） 8616392， E-mail:xinanwu6511@163.com