HPLC法检测不同地区野生槐花花蕾中芦丁与槲皮素

张俊鹏, 张宝婵, 李瑞明, 林 颖, 刘 怡, 林银奎, 陈小陆

（中山大学附属第一医院, 广东 广州 510080）

HPLC法检测不同地区野生槐花花蕾中芦丁与槲皮素

张俊鹏, 张宝婵, 李瑞明*, 林 颖, 刘 怡, 林银奎, 陈小陆

（中山大学附属第一医院, 广东 广州 510080）

目的 建立 HPLC法测定不同产地的野生槐花花蕾中芦丁与槲皮素的量。 方法 采用碱水提取法提取槐花花蕾中的芦丁和槲皮素。 采用 Agilient HC-C18（4.6 mm×250 mm， 5 μm） 色谱柱， 以甲醇-0.4%磷酸水溶液 （52 ∶48 ） 为流动相， 体积流量为 0.9 mL/min; 检测波长为 360 nm; 柱温为 25 ℃。 结果 芦丁在 2.5 ～80 μg/mL范围内， 槲皮素在 0.625 ～20 μg/mL范围内线性关系良好; 平均回收率分别为 100.2%和 99.1%;RSD分别为 2.1%和 1.1% （n= 6）。 来自 10 个产地的槐花花蕾中芦丁的量在 21.48% ～28.21%之间， 槲皮素的量在 1.15% ～1.74%之间。 结论 不同产地槐花花蕾中芦丁和槲皮素存在一定差异，其中以河南新郑的槐花花蕾中芦丁与槲皮素含有量最高。

槐花花蕾;芦丁;槲皮素

黄酮类作为一类重要的植物次生代谢产物，具有良好的抗氧化活性， 早在 19 世纪 50 年代，就引起了食品和药品行业的广泛关注［1］。 黄酮类具有广泛的功效，可有效地清除体内的氧自由基，防止氧自由基损伤细胞膜和 DNA， 这种抗氧化作用可用于预防细胞的衰老与退化，并有利于预防癌症的发生［2］。

槐花花蕾为我国传统中药材，在各地均有分布，主产于河南、山东、山西、陕西、安徽、河北、江苏等地。药理研究和临床试验表明，槐花花蕾具有抗肿瘤、 抗癌［3］、 抗生育［4］和止血活性［5］，其主要活性成分为黄酮类化合物。槐花花蕾中富含黄酮类成分，如芦丁、槲皮素、山柰酚等。芦丁（rutin） 是一种无毒的生物类黄酮， 目前已在 70 多种植物中发现［6］。 芦丁有抗炎、 维生素 P样作用和抑制醛糖还原酶的作用，它在人体内的毒性很低，在临床上用于治疗腋窝淋巴结切除后的淋巴水肿［7］等疾 病。槲 皮素同样具 有 广泛的生物 活 性，包括诱导细胞凋亡，抑制肿瘤细胞增殖、细胞浸润和血管新生［8］等， 同时作为一种抗氧化剂， 它也可以保护正常细胞免受氧化应激和突变［9］。 目前，市场上已有芦丁的相关制剂，如复方芦丁片和复方三嗪芦丁片，分别用于治疗毛细血管出血症和高血压病［10］。

槐花花蕾为提取芦丁和槲皮素的一种重要原料，而我国野生槐花花蕾资源丰富，且大量出口，如何对野生槐花花蕾的质量进行控制，提高其有效利用率显得尤为重要。因此，本研究对不同产地野生槐花花蕾中芦丁和槲皮素的量进行研究，为槐花花蕾的质量控制提供一定的理论依据和实验基础。

1 仪器与试药

1200 型高效液相色谱仪 （Agilent）; 磷酸、 盐酸、氢氧化钙等购自广州化学试剂厂，均为分析纯; 蒸馏水 （屈臣氏）; 色谱甲醇 （Merck）。 芦丁（中 国 食 品 药 品 检 定 研 究 院， 批 号 100080-201207）、 槲皮素 （中国食品药品检定研究院，批号 100081-201206）。 槐花花蕾采自河南新郑、 河南许昌、山东泰安、山东济南、山西运城、广西全州、安徽亳州、江苏无锡、河北石家庄、北京。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 供试品溶液的制备 取 30 g槐花花蕾粉末， 加0.4%硼砂沸水 200 mL， 搅拌下加入适量饱和石灰水溶液调 pH 8 ～9， 加热保持微沸， 并不断搅拌， 煮沸 15 min 后趁热抽滤， 滤渣重复提取 2次，抽滤。合并 3次滤液，然后用浓盐酸调节pH 3 ～4。 放置 2 h， 使沉淀完全， 抽滤， 得样品。将样品干燥后称定质量，精密称取适量样品置于10 m L量瓶中， 加适量甲醇定容， 摇匀， 即得供试品溶液。

2.1.2 对照品溶液的制备 分别精密称取在120 ℃干燥至恒定质量的芦丁和槲皮素对照品5.02 mg、 5.05 mg， 分别置于 50 mL量瓶中， 加适量甲醇溶解，定容至刻度，摇匀。

2.2 色 谱 条 件 色 谱 柱 Agilient HC-C18（ 4.6 mm×250 mm， 5 μm）; 流动相 A为甲醇， 流动相B为 0.4%的磷酸 （A） -水溶液 （B） （52 ∶48），体积流量 0.9 m L/min; 检 测 波 长 360 nm; 柱 温25 ℃; 进样量 10 μL。

2.3 标准曲线的建立 精密吸取对照品溶液适量，分别置于量瓶中，加入适量甲醇，定容至刻度，得到芦丁的质量浓度分别为 2.5、 5.0、 10.0、 20.0、40.0、80.0 μg/mL， 槲 皮 素 的质 量 浓 度 分 别 为0.625、 1.25、2.5、5.0、 10.0、 20.0 μg/mL，过滤后按照上述色谱条件进样。分析结果表明，芦丁在 2.5 ～80.0 μg/m L、 槲 皮 素 在 0.625 ～20.0 μg/mL范围内和峰面积线性关系良好。 芦丁的线性回归方程为 Y=0.026 7X+0.302， r=0.999; 槲皮素的线性回归方程为 Y=0.013 1X+0.372 8， r= 0.999 2。

2.4 精密度试验 取 “2.1.2” 项下芦丁和槲皮素对照品溶液，按上述色谱条件进样6次，结果芦丁和槲皮素的峰面积 RSD分别为 0.3%和 0.4%，表明仪器精密度良好。

2.5 重复性试验 精密称取河南新郑产槐花花蕾30 g， 共 6 份，按 “2.1.1”项下制备供试品溶液，按上述色谱条件进行测定。 6 份样品测定结果 RSD为 0.8%， 表明重复性良好。

2.6 稳定性试验 取 “2.1.1”项下样品溶液，室温放置 0、 1、2、 4、 8、16、 24、 48 h 后分别测定， 芦丁和槲皮素峰面积的 RSD分别为 1.0%和1.6%， 表明样品溶液在 48 h 内稳定。

2.7 加样回收率试验 精密称取 6 份已知含有量的河南新郑槐花花蕾样品各 1.0 mg， 分别精密加入一定量的芦丁和槲皮素对照品溶液，按“2.1.1” 项制备成供试品溶液， 按上述色谱条件测定， 计算， 芦丁的平均加样回收率为 100.2%，RSD为 2.1%; 槲 皮 素 的 平 均 加 样 回 收 率 为99.1%， RSD为1.1%。 具体见表 1， 表 2。

2.8 样品的测定 分别取各个产地的样品溶液，按上述色谱条件测定，计算芦丁和槲皮素的量，结果见表3和图1。

表1 芦丁的加样回收率Tab.1 Results of recovery tests for rutin

表2 槲皮素的加样回收率Tab.2 Results of recovery tests for quercetin

表 3 芦丁和槲皮素测定结果 （n=3）Tab.3 Content determ ination of ru tin and quercetin （ n= 3）

图1 对照品和供试品的 HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatogram s of reference substances and sam p les

3 讨论

3.1 提取方法的确定 目前从槐花花蕾中提取芦丁和槲皮素的方法主要有微波提取法［11］、 冷碱提取法［12］、 热提冷 析法［13］、 超声提取法［14］。 采用超声提取法等有机溶剂提取的方法得到的杂质较多，需要进一步分离纯化才能得到纯度较高的芦丁和槲皮素。而采用碱水提取法既可得到纯度较高的芦丁和槲皮素，又避免了使用有机溶剂对环境的污染和破坏，故本实验采用碱水提取法。

3.2 流动相的选择 本实验考察了甲醇-水、 乙腈-水等不同的流动相体系进行分析， 结果表明甲醇-水、 乙腈-水体系都能将芦丁和槲皮素分离开， 但拖尾严重， 在甲醇-水系统中加入少量的磷酸可有效的改善拖尾现象，使峰型较好。由图1可知，该色谱条件下， 芦丁和槲皮素的分离度 R大于 1.5，分离效果好，且分离周期短。

3.3 对不同产地槐花花蕾芦丁和槲皮素的比较

由表1知，不同产地槐花花蕾中芦丁和槲皮素的含有量不同， 芦丁在 21.48% ～28.21%之间， 槲皮素在 1.15% ～1.74%之间， 有一定的波动。 二者均以河南新郑为最高，山东济南次之，江苏无锡最低。不同产地槐花花蕾中芦丁和槲皮素的量有所差异，这与槐树的生长环境 （日照时间、 温度、 降雨量、土壤等）有密切关系。另外，当芦丁的量高时，槲皮素的量也高，反之相同。这可能与芦丁和槲皮素在槐花花蕾中的生物合成途径有关，芦丁是由槲皮素和两分子葡萄糖结合成糖苷形成的。

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Analysis of rutin and quercetin in flower buds of w ild Sophora japonica L.from different habitats by HPLC

ZHANG Jun-peng， ZHANG Bao-chan， LIRui-ming*， LIN Yin， LIU Yi， LIN Yin-kui，CHEN Xiao-lu
（ The First Affiliated Hospital of SunYat-Sen University， Cuangzhou 510080， China）

AIM To establish an HPLCmethod to determine rutin and quercetin in flower buds ofwild Sophora japonica L.from eighthabitats.METHODS Rutin and quercetin of flower buds of S.Japonica were extracted by alkaline solution，and were determined by HPLCmethod.Chromatography was performed on an Agilient HC-C18（ 4.6 mm×250 mm， 5 μm） at25 ℃ ， andmobile phasewas composed ofmethanol-0.4%phosphoric acid solution（ 52 ∶48） with a flow rate of0.9 m L/min.The detection wavelength was setat360 nm.RESULTS The linearity of rutin and quercetin were 2.5-80 μg/mL and 0.625-20 μg/mL，respectively，the average recoveries were 100.2%and 99.1%， and their RSD were2.1%and 1.1% （ n=6） ， respectively.The rutin content ranged from 21.48%to 28.21%， while quercetin content ranged from 1.15%to 1.74%.CONCLUSION There are some differences in the contents of rutin and quercetin in flower buds of S.japonica in different habitats.Of these habitats the contents of rutin and querectin in the flower buds from Henan province are the highest.

flower buds of Sophora japonica L.;rutin;quercetin

R284.1

:A

1001-1528（2014）11-2573-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.11.029

2013-11-21

广东省中医药局科研项目 （20121145）

张俊鹏， 主管药师， 研究方向: 医院药学。 E-mail:871105760@QQ.com

*通信作者: 李瑞明， 主管药师， 研究方向: 医院制剂。 E-mail:liruiming321@163.com