血清GP73和AFP等十项肿瘤标志物联合诊断HBsAg阳性肝癌的研究

2014-04-12董飞波高国生徐晓珍祝成亮颜卫华

浙江医学 2014年3期

董飞波高国生徐晓珍祝成亮颜卫华

●论著

董飞波高国生徐晓珍祝成亮颜卫华

目的探讨血清高尔基体蛋白73（GP73）及甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、铁蛋白（SF）、糖基抗原（CA19-9、CA15-3、CA125）、碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰基转肽酶（GGT）、亮氨酸氨基转肽酶（LAP）等肿瘤标志物单项和联合检测对乙型肝炎（乙肝）病毒表面抗原（HBsAg）阳性肝癌的诊断价值。方法收集85例慢性乙肝、74例乙肝肝硬化、133例HBsAg阳性肝癌患者及46例健康体检者的血清，对GP73及AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP等肿瘤标志物进行检测，并对检测结果进行统计学分析。结果Spearman相关分析表明血清GP73与AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP均有一定的相关性（均P＜0．05），除CA125外，肝癌组的相关系数均比非肝癌组小；但只有GP73与AFP、GGT及LAP的相关性在两组间的差异有统计学意义（均P＜0．05）。GP73、AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP在慢性乙肝组、乙肝肝硬化组、肝癌组和正常对照组中的差异均有统计学意义（均P＜0．05），肝癌组的GP73、AFP、LAP的血清水平均显著高于其他组（均P＜0．05）。ROC曲线分析表明，单项指标中以GP73的ROC曲线下面积最大（AUC=0．792）,但与AFP和ALP的差异不大（Z=0．127、1．908，P=0．899、0．056）。通过logistic回归对上述指标构建新的预测模型，联合预测因子（PRE）的AUC显著高于其它单项指标（均P＜0．05）。结论GP73单项检测有较好的诊断作用，GP73联合AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP检测可提高对HBsAg阳性肝癌的诊断效能。

原发性肝癌高尔基体蛋白73 甲胎蛋白 ROC曲线

近年来，高尔基体蛋白73（GP73）被认为是最值得期待的血清标志物之一，有多篇文献报道GP73对诊断肝癌方面有较好的价值[1-3]，但GP73联合其它血清学标志物对肝癌，特别是国内以乙型肝炎（乙肝）为基础的肝癌的诊断研究报道较少。本研究通过检测血清GP73及甲胎蛋白（AFP）、癌胚抗原（CEA）、铁蛋白（SF）、糖基抗原（CA19-9、CA15-3、CA125）、碱性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰基转肽酶（GGT）、亮氨酸氨基转肽酶（LAP）等常用肿瘤标志物在不同类型乙肝相关疾病中的表达情况，探讨其单项和联合检测对HBsAg阳性肝癌的诊断价值，现将结果报道如下。

1 对象和方法

1.1 对象选取2010-01—2013-05在宁波市第二医院住院的患者血清标本292例，其中慢性乙肝患者85例，男67例，女18例，年龄20～75岁，平均（38.99± 11.62）岁；乙肝肝硬化患者74例，男49例，女25例，年龄33～81岁，平均（54.88±11.04）岁；肝癌患者133例，男120例，女13例，年龄33～85岁，平均（55.14±10.74）岁。所有患者均有HBV感染的病因学基础（HBsAg阳性），同时排除其他肝炎病毒感染。对肝癌患者进行临床分期，其中Ⅰ期35例，Ⅱ期35例，Ⅲ期63例。所有患者的诊断标准、肝癌临床分期标准均符合中华医学会制定的《慢性乙型肝炎防治指南》[4]及第4届全国肝癌学术大会讨论通过的原发性肝癌诊断标准[5]，且肝癌患者均未行手术、介入、化疗、分子靶向治疗。另选取同期健康体检者46例作为正常对照组，其中男35例，女11例，年龄18～77岁，平均（33.37±12.92）岁。本研究经医院伦理委员会批准，所有对象均签署知情同意书。

1.2 方法受检者均采集清晨空腹静脉血5ml，分离后的血清于-20℃冰箱保存待测。GP73测定采用酶联免疫吸附试验（定量）检测，试剂盒由北京热景生物技术有限公司提供；AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125检测采用微粒子酶免疫分析技术，仪器为美国ABBOTT AXSYM全自动免疫分析仪，原装试剂盒；ALP、GGT采用AU2700全自动生化分析仪检测，原装试剂盒；LAP采用AU2700全自动生化分析仪检测，试剂盒由长春汇力生物技术有限公司提供。

1.3 统计学处理应用SPSS16.0统计软件。血清GP73、AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP检测结果经过正态性检验呈偏态分布，采用中位数（四分位数）表示；多组间比较采用Kruskal-Wallis H检验，两两比较采用Nemenyi法。双变量间相关性采用Spearman相关分析。绘制ROC曲线并采用ROC曲线下面积（AUC）评价血清GP73和AFP对肝癌的诊断价值。多因素logistic回归分析的引入标准为P＜0.05，剔除标准为P＞0.10，方法为Backward:wald；logistic回归构建新的预测模型参照文献[6]。AUC和相关系数的比较运用正态性Z检验。

2 结果

2.1 血清GP73与9种肿瘤标志物的相关性分析根据患者是否患肝癌分为非肝癌组和肝癌组，对血清GP73及AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP进行Spearman相关分析，结果表明两组中血清GP73与其它肿瘤标志物均有相关性（均P＜0.05）。除CA125外，肝癌组的相关系数均比非肝癌组小，但只有GP73与AFP、GGT及LAP的相关性在两组间的差异有统计学意义（P＜0.05），详见表1、图1。

表1 血清GP73与9种肿瘤标志物的相关性分析

2.2 血清GP73与9种肿瘤标志物检测结果的比较 GP73、AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、 GGT、LAP在慢性乙肝组、乙肝肝硬化组、肝癌组和正常对照组中的差异均有统计学意义（均P＜0.05），其中肝癌组的GP73、AFP、LAP水平均显著高于其他组（均P＜0.05），详见表2。

图1 血清GP73与AFP在非肝癌组和肝癌组中的相关性

2.3 血清GP73和9种肿瘤标志物单项及联合检测诊断肝癌的ROC曲线分析以正常人及良性肝病患者作为对照组，对GP73和其它9种肿瘤标志物进行多因素logistic回归分析构建新的预测模型，并得到联合预测因子（PRE），PRE=CA15-3+0.1447GP73+0.0263AFP+ 0.1447LAP。利用ROC曲线分析各肿瘤标志物及联合预测因子对肝癌的诊断效能，结果发现单项指标中，以GP73的ROC曲线下面积最大（AUC=0.792），但与AFP和ALP的差异无统计学意义（Z=0.127、1.908，P＞0.05）；而PRE的AUC显著高于其它所有单项指标（均P＜0.05），详见表3、4、图2。

表2 血清GP73与9种血清学标志物检测结果的比较

表3 GP73与9种肿瘤标志物logistic回归分析结果

2.4 血清GP73和其它9种肿瘤标志物单项对良性肝病的ROC曲线分析（1）以正常人和乙肝肝硬化及肝癌患者作为对照组，利用ROC曲线分析各肿瘤标志物对慢性乙肝的诊断效能，所有单项指标（包括GP73）AUC＜0.600（GP73、AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP的AUC分别为0.373、0.347、0.338、0.570、0.472、0.268、0.255、0.374、0.560、0.550）。（2）以正常人和慢性乙肝及肝癌患者作为对照组，利用ROC曲线分析各肿瘤标志物对乙肝肝硬化的诊断效能，单项指标仅CEA和CA125的AUC＞0.700（AUC=0.719、0.734），其余指标（包括GP73）的AUC均＜0.600。

表4 GP73与其它9种肿瘤标志物及联合预测因子诊断肝癌的AUC

2.5 血清GP73与9种肿瘤标志物与肝癌临床分期的关系所有肿瘤标志物的血清水平均随着肝癌临床分期的增加而逐步升高；经Kruskal-Wallis H检验，除CEA外的其余指标均有统计学意义（均P＜0.05）。

图2 GP73、其它9种肿瘤标志物及联合预测因子诊断肝癌的ROC曲线

3 讨论

肝癌的诊断，特别是早期诊断一直是临床研究的热点和难点。作为目前最有效、最常用的标志物，AFP虽应用于临床数十年，但其敏感性仅40%～65%，特异性仅76%～96%。GP73的发现似乎为这一难题的解决提供了契机，但国内外的研究结论并不完全一致。Marrero等[1]、Riener等[7]及国内的Mao等[3]、Hu等[8]均认为GP73比AFP更有效，但Morota等[9]和杨颖等[10]则认为GP73和AFP的诊断价值相当（其AUC分别为0.78和0.81）。由此，GP73和AFP及其它肿瘤标志物的联合检测可能有更好的诊断价值[3，7，11]。

本研究结果表明，血清GP73与AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP均有一定的相关性（均P＜0.05），但除CA125外，肝癌组比非肝癌组的相关性要差，这提示GP73与其它肿瘤标志物存在互补的可能，且慢性乙肝组、乙肝肝硬化组、肝癌组血清GP73与其它9种肿瘤标志物水平均高于正常对照组，特别是肝癌组的GP73、AFP、LAP的血清水平均显著高于其他组（均P＜0.05）。因此，如将GP73与AFP、LAP等肿瘤标志物联合检测，则有可能提高诊断效能。

联合诊断试验一般有两种方法，即平行（或称并联）试验和系列（或称串联）试验，两者无法同时提高敏感性和特异性。其中平行试验，即一系列试验中任何一试验呈阳性其结果即判为阳性，提高了敏感性（至少是相等），却降低了特异性；而系列试验，即一系列试验中所有试验均为阳性其结果才判为阳性，提高了特异性（至少是相等），却降低了敏感性。但是通过多因素logistic回归分析构建新的预测模型，可以有效解决上述问题[6]。ROC曲线分析结果表明，单项指标中，以GP73的诊断价值最好（AUC=0.792），但与AFP和ALP的差异不大，这与Morota等[9]和杨颖等[10]的观点一致；而联合预测因子的AUC显著高于其它所有单项指标（均P＜0.05），证明联合检测确实可以提高肝癌的诊断效能。

总之，GP73单项检测对HBsAg阳性肝癌有较好的诊断价值，GP73联合AFP、CEA、SF、CA19-9、CA15-3、CA125、ALP、GGT、LAP检测可有效提高对肝癌的诊断效能。由于本文所选择的病例有限，在异质性、研究人群、测试设备或方法等方面难免存在偏倚，更确切的结论还需要多中心、大样本的实验数据对其进行支持。

[1]Marrero J A,Romano P R,Nikoheva O,et al．GP73,a resident Golgi glycoprotein,is a novel serum marker for hepatocellular carcinoma [J]．J Hepatol,2005,43(6)：1007-1012．

[2]Giannelli G,Antonaci S．New frontiers in biomarkers for hepatocellular carcinoma[J]．Dig Liver Dis,2006,38(11)：854-859．

[3]Mao Y,Yang H,Xu H,et al．Golgi protein 73(GOLPH2)is a valuable serum marker for hepatocellular carcinoma[J]．Gut,2010,59(12)：1687-1693．

[4]中华医学会肝病学分会、感染病学分会．慢性乙型肝炎防治指南[J]．中华肝脏病杂志,2005,13(12)：881-891．

[5]中国抗癌协会肝癌专业委员会．原发性肝癌诊断标准[J]．中华肝脏病杂志,2000,8(3)：135．

[6]高国生,冯家飞,丁世雄．甲胎蛋白、铜蓝蛋白和触珠蛋白联合诊断原发性肝癌评价[J]．中国卫生检验杂志,2011,21(12)：2833-2834．

[7] Riener M O,Stenner F,Liewen H,et al．Golgi phosphoprotein 2 (GOLPH2)expression in liver tumors and its value as a serum marker in hepatocellular carcinoma[J]．Hepatology,2009,49(5)：1602-1609．

[8]Hu J S,Wu D W,Liang S,et al．GP73,a resident Golgi glycoprotein, is sensibility and specificity for hepatocellular carcinoma of diagnosis in a hepatitis B-endemic Asian population[J]．Med Oncol, 2010,27(2)：339-345．

[9]Morota K,Nakagawa M,Sekiya R,et al．A comparative evaluation of Golgi protein-73,fucosylated hemopexin,alpha-fetoprotein,and PIVKA-II in the serum of patients with chronic hepatitis,cirrhosis, and hepatocellular carcinoma[J]．Clin Chem Lab Med,2011,49(4)：711-718．

[10]杨颖,肖蕾,毛睿,等．高尔基体糖蛋白73的表达特征及其对肝癌与肝硬化的鉴别诊断价值[J]．中华肝脏病杂志,2012,20(12)：920-924．

[11]Tian L,Wang Y,Xu D,et al．Serological AFP/golgi protein 73 could be a new diagnostic parameter of hepatic diseases[J]．Int J Cancer,2010,129(8)：1923-1931．

Single detection of Golgi protein 73 and combined with other serum tumor markers in diagnosis of HBsAg-positive hepatocellular car-cinoma

Objective To evaluate single detection of Golgi protein 73(GP73)or combined with other serum tumor markers in diagnosis of HBSAg-positive hepatocellular carcinoma(HCC)．MethodsSerum samples were collected from 133 cases of HBsAg-positive HCC,85 cases of chronic hepatitis B (CHB),74 cases of liver cirrhosis(LC)infected with HBV and 46 healthy subjects．Serum levels of GP73,AFP,CEA,SF,CA19-9,CA15-3,CA125,ALP,GGT and LAP were assayed and the results were analyzed．ResultsSpearman correlation analysis showed that levels of serum GP73 was associated with the levels of AFP,CEA, SF,CA19-9,CA15-3,CA125,ALP,GGT and LAP(P＜0．05),not with CA125;the correlation coefficient of AFP,GGT and LAP in HCC group were lower than that in non-HCC group(P＜0．05)．There were significant differences in serum levels of GP73,AFP, CEA,SF,CA19-9,CA15-3,CA125,ALP,GGT and LAP between CHB,LC,HCC patients and normal controls(P＜0．05)．The serum levels of GP73,AFP and LAP in HCC group were significantly higher than those in other groups(P＜0．05)．ROC curve analysis showed that there was no significant difference in area under ROC among GP73,AFP and ALP (Z=0．127 and 1．908 respectively,P=0．899 and 0．056 respectively),although the AUC of GP73 was the largest(AUC=0．792）．By logistic regression,we used all these indicators to build a new prediction model．The results showed that the AUC of the combined markers was significantly higher than any single markers(P＜0．05)．ConclusionGP73 is a high sensitive and specific serum mark for diagnosis of PHC and the detection of GP73 combined with AFP,CEA,SF,CA19-9,CA15-3,CA125,ALP,GGT and LAP can improve the diag-nostic value for HBsAg-positive HCC patients．

Hepatocellular carcinoma Golgi protein 73 Alpha fetoprotein ROC curve