精子发生的内分泌激素调节

李江源

（解放军总医院内分泌科，北京 100853）

精子发生是一个复杂的生物学过程，精原干细胞（As）具有自我复制能力，As细胞分化产生Apr和Aal精原细胞，Aal细胞进一步分化为A1-4和B型精原细胞，后者减数分裂形成精母细胞，精母细胞经过细线期、偶线期和粗线期形成单倍体精子细胞，再经过变态形成精子。精子从生精小管上皮释放入管腔，进入附睾继续发育，成为可以使卵子受精的成熟精子［1］。正常的精子发生有赖于下丘脑-垂体-性腺（HPG）轴系功能的完整，下丘脑分泌的促性腺激素释放激素（GnRH）和促性腺激素抑制激素（GnIH）；垂体分泌的卵泡刺激素（FSH）和黄体生成激素（LH）以及睾丸分泌的睾酮（T）和雌二醇（E2）相辅相成，构成负反馈调节轴系，维持着精密的生理平衡，是精子发生的必备条件。此外，激素受体和受体后信号转导，局部的旁分泌和自分泌激素以及细胞因子、生长因子和化学刺激因子等也是不可或缺的［2］。近年来利用转基因动物模型对上述内分泌激素调节精子发生进行了大量的研究，使我们对精子发生过程内分泌激素的调节有了更加深入的认识。本文简要回顾这方面的进展。

一、促性腺激素释放激素（GnRH）

人类的GnRH 神经元约有1 000个，细胞呈圆形、卵圆形或梭形，定位于下丘脑前区和视前区，沿嗅球后部到弓状核散在分布，其轴突经过下丘脑-漏斗束到达正中隆突。GnRH 神经元合成和分泌GnRH（也称GnRH1）10肽，通过正中隆突-垂体门脉系统进入垂体前叶，作用于促性腺细胞。另一组GnRH 神经元的轴突经终板血管器止于血脑屏障［3］。人类的GnRH 受体为1型受体（GnRHR1），是视紫质样G-蛋白受体超家族成员，分布于垂体、胎盘、性腺、乳腺、前列腺和免疫细胞。GnRHR1有7个穿膜环，第7个穿膜环的细胞内部分C-端缺失，C-端与受体内在化和失敏感性有关，C-端缺失有助于防止受体迅速内在化［4］。

在调节生殖的内分泌激素系统中，GnRH 神经元处于最顶端，GnRH 神经元脉冲式分泌GnRH 是青春期发育启动的标志，而精子发生则是青春期发育三个重大事件（第二性征发育、精子发生和迅速长高）之一。脉冲分泌方式是GnRH 神经元的固有特性，与细胞间的信号交流无关。GnRH 神经元之间形成神经网络，在功能上协调一致，称为“脉冲发生器”。GnRH 脉冲在男性相对固定，90～120min一个脉冲，胚胎期因为GnRH 神经元迁徙、发育或功能异常，可引起无青春期发育和不育，临床上称为特发性低促性腺激素性性腺功能减退（IHH）或Kallmann综合征；女性的GnRH 脉冲频率有周期性变化，30～120min一个脉冲，频率变化是月经周期的基础，其机制未明；频率过低可引起下丘脑性闭经和不育；而长期高频率可导致不育和多囊卵巢综合征（PCOS）。通过外周血管5～10min频繁采血，进行LH 脉冲分析，是研究人类下丘脑GnRH 脉冲分泌的重要方法［5］。LH 的脉冲频率与GnRH 脉冲频率的同步率大于90%，FSH 脉冲的同步率较低，原因可能是目前FSH 的测定方法灵敏度不高［6］。

GnRH 调节垂体前叶促性腺细胞的分泌功能，脉冲式间断刺激起兴奋作用，连续刺激起抑制作用；较快的频率有助于糖蛋白α-亚单位（GαSU）和黄体生成素β亚单位（LHβ）的合成，而较慢的频率促进卵泡刺激素β亚单位（FSHβ）的合成。其机制仍未完全阐明，目前认为，受体后信号转导的途径不同是重要的原因之一。GnRH 与GnRHR1结合后的信号转导涉及丝裂原激活蛋白激酶（MAPK），细胞外信号调节激酶（ERK），jun-N-端激酶（JNK）和P38。在体外培养条件下，以不同频率的GnRH 刺激纯化垂体促性腺细胞，发现低频率激活MAPK-ERK 途径更快和更持久，促进了FSHβ的转录；而高频率则MAPK 磷酸酶途径的反应更强，有利于LHβ的合成［7］。

体外培养的大鼠Leydig细胞经GnRH 激动剂阿拉瑞林（alarelin）处理后，3β-类固醇脱氢酶的表达增强，T 的合成和分泌增加。早期研究已证明Sertoli细胞能分泌GnRH，GnRH 在睾丸内可能是以旁分泌方式调节Leydig细胞分泌T 的功能［8］。

二、促性腺激素抑制激素（GnIH）

每一种细胞功能的调节都是既有促进因子，也有抑制因子，以维持平衡。自1971年在猪的下丘脑发现GnRH 以来，许多科学家一直在寻找与GnRH对应的抑制激素而没有结果，直至2000年Tsuksui等［9］在鹌鹑垂体培养的研究中发现了GnIH。后来在脊柱动物和哺乳动物得到了证实。人类的GnIH有两种分子，分别称为RF 相关肽-1（RFRP-1）和-3（RFRP-3），它们的受体分别称为NPFF1（GPR 147）和NPFF2（GPR 74）。GnIH 定位于下丘脑背内侧核和室周核。功能研究提示，GPR 147的亲和力高，是GnIH 的主导受体。GnIH 的生理作用一是抑制GnRH神经元合成和释放GnRH，二是直接抑制垂体促性腺细胞合成和分泌LH 和FSH，人类垂体存在GPR 147受体［10］。

Smith等［11］通过对动情期和动情间期母羊垂体门脉采血测定GnIH，发现GnIH 呈脉冲式分泌，动情间期的脉冲频率和幅度比动情期高。下丘脑-垂体离断母羊，LH 对GnRH 的反应程度在加入GnIH 后减低，表明GnIH 是通过垂体门脉系统进入垂体前叶，并调节其功能的。Zhou等［12］研究GnIH 和GPR 147在地鼠睾丸的表达，发现GnIH 在精母细胞、圆形精子细胞和早期长形精子细胞表达；GPR 147在精子发生的各期生精细胞、管周肌样细胞、粗线期和成熟分裂精母细胞以及圆形和后期长形精子细胞表达。提示GnIH 在地鼠睾丸有旁分泌和自分泌作用，调节生精细胞的分化。

三、黄体生成激素（LH）

LH 和FSH 属于糖蛋白激素，分子结构为二聚体（α-和β-亚单位）。它们有相同的GαSU，LHβ和FSHβ表达各自的生物学特性，β-亚单位也是各自合成LH 和FSH 的限速步骤。LH 和FSH 是直接调节睾丸精子发生的激素，可以说是精子发生启动的开关，其作用十分重要。

LH 的主要作用是促进Leydig细胞合成和分泌T，一方面维持正常的血浆T 水平，另一方面维持比外周循环约高100倍的睾丸内T 浓度，睾丸内T 以旁分泌方式作用于Sertoli细胞和管周肌样细胞，是正常精子发生所必需的；以自分泌方式作用于Leydig细胞本身，维持细胞的数量和功能。LHβ基因失活性突变的男性胎儿宫内发育正常，因为胎盘分泌的绒促性素补偿了缺失的LH，但是，无青春期发育和精子发生［13］。敲除LHβ基因的雄性小鼠隐睾，T 水平低，无精子发生。LH 受体基因敲除（LuRKO）小鼠睾丸小，T水平降低、LH 水平升高，生精细胞分化停滞于圆形精子细胞早期阶段。与正常小鼠比较，LuRKO小鼠睾丸全基因组转录，存在青春期前T 不敏感期和青春期后的T 敏感期，在T 敏感期补充T 治疗可以纠正LuRKO 的生理缺陷［14］。在女性，LH 刺激卵泡膜细胞合成雄激素，刺激颗粒细胞合成孕酮，FSH 则刺激颗粒细胞芳香化酶表达，将雄激素转化为雌激素。敲除LHβ或LHR 基因的雌性小鼠，性激素水平降低，卵泡发育停滞［15］。

四、卵泡刺激素（FSH）

FSH 主要作用于Sertoli细胞，刺激其增殖（决定数量）和分化（功能成熟）。成年恒河猴切除一侧睾丸后，对侧睾丸体积增大，4代分化精原细胞、粗线期精母细胞和圆形精子细胞数量增加，血浆FSH 水平和睾丸内T 水平增高。切除垂体或注射GnRH拮抗剂的恒河猴，单独补充FSH 或T 都可以刺激精原细胞的分化。恒河猴的内源性FSH 和LH 被GnRH 拮抗剂阻断后，立即分别以脉冲方式输入重组人FSH（rhFSH）或重组人LH（rhLH），以血浆FSH 和LH 达到拮抗剂阻断前水平为正常化终点。与对照组比较，输入rhFSH 组睾丸容积、生精小管容积和每个Sertoli细胞内的生精细胞数量显著增加，增加的生精细胞主要是4代B型精原细胞、粗线期精母细胞和圆形精子细胞，而Aps和Apl无明显变化；输入rhLH 组没有这种变化［16］。

GnRH 基因修饰导致不能产生正常GnRH 10肽分子的促性腺激素缺乏小鼠（hpg）和敲除Sertoli细胞雄激素受体（AR）的hpg小鼠（hpg.SCARKO）的生精细胞仍有部分发育；而全部AR 敲除hpg 小鼠（hpg.ARKO）与hpg小鼠比较，睾丸缩小、Sertoli细胞和生精细胞数量减少。注射hrFSH 7d后，hpg小鼠精原细胞和精母细胞数量增加，有圆形精子细胞形成；hpg.SCARKO和hpg.ARKO 小鼠只有精原细胞和精母细胞数量增加，没有圆形精子细胞出现。hpg和hpg.SCARKO 小鼠的Leydig 细胞数量增加，而hpg.ARKO小鼠则否。说明FSH 可以诱导精子发生，但不能完成减数分裂；FSH 通过AR 对维持Leydig细胞数量起重要作用［17］。与正常小鼠比较，FSH 受 体 敲 除（FSHRKO）、SCARKO、FSHRKOSCARKO、ARKO 和FSHRKO-ARKO 各型转基因小鼠在出生后，睾丸容积逐渐缩小，萎缩的严重程度依 次 为FSHRKO-ARKO ＞ARKO ＞FSHRKOSCARKO＞SCARKO＞FSHRKO，到了成年期，情况最好的FSHRKO 小鼠，睾丸容积比正常小鼠缩小了约40%；Leydig 细胞数量减少以FSHRKOARKO 和ARKO 小 鼠 最 严 重，FSHRKO 和FSHRKO-SCARKO 小鼠轻度减少，SCARKO 小鼠无明显变化。生精细胞在FSHRKO-ARKO 小鼠几乎完全 消 失，FSHRKO-SCARKO 和ARKO 小 鼠 严 重 减少，FSHRKO 和SCARKO 小鼠轻度至中度减少。上述结果表明，正常精子发生需要FSH 和T 的协同作用，缺乏任何一方，都会使睾丸的各型细胞受损，如果两者都缺乏，则不能启动精子发生［18］。

FSH 对女性生殖是不可或缺的，对男性亦起重要作用，但并非必须。FSHβ基因突变的男性患者仍有青春期发育，只是无精子发生［19］。FSHβ 或FSHR 基因敲除雄性小鼠睾丸小、血清T 水平显著降低、Leydig细胞数量减少、少精子；而雌性小鼠无卵泡发育、不育［20］。

五、睾酮（T）

T 对于精子发生具有非常重要的作用，T 反馈抑制LH 的释放，却能刺激FSH 的分泌，这是促性腺激素缺乏患者补充T 可以诱导精子发生的原因。Leydig细胞在睾丸内创造了一个非常高浓度的T环境（340～2 000nmol／L），而血清水平只有8.7～35nmol／L，前者是后者的25～125倍，如果睾丸内的T 浓度＜70nmol／L，精子发生过程不会启动。AR 存在于Sertoli细胞、Leydig细胞和管周肌样细胞，生精细胞是否存在AR 尚无定论，从功能上看，生精细胞并不需要AR。T 对精子发生所起的作用体现在：（1）促进血睾屏障紧密连接（tight junction，TJ）的构成和功能；（2）促进附睾的发育和功能；（3）促进生精细胞在Sertoli细胞的附着和分化；（4）促进精子释放［21］。

1.紧密连接（TJ）的构成：TJ从青春期精子发生开始，两个Sertoli基底部之间形成TJ，将生精小管分隔为基底室和近腔室，前者只有精原细胞，后者含有精母细胞和各期精细胞。TJ不仅保护生精细胞免受免疫系统的攻击，亦为生精细胞构建了一个特异性激素、细胞因子和营养环境。睾丸灌注高渗液体是评价血睾屏障的一种方法，10d龄正常小鼠和SCARKO 小鼠灌注后生精小管所有细胞皱缩，提示尚无有效血睾屏障形成；15d龄正常小鼠灌注后皱缩的细胞显著减少，提示血睾屏障已开始构建，而SCARKO 鼠尚无这种变化。定量分析显示，50d龄成年期正常小鼠99.7%已建立了完整的血睾屏障，而SCARKO 小鼠只有84.7%。电镜观察，正常小鼠10d龄时，生精细胞与Sertoli细胞之间以及Sertoli细胞与Sertoli细胞之间放射性镧可以自由通过，15d龄时，大多数生精小管已形成TJ结构，放射性镧被挡在管腔侧；而SCARKO 小鼠出现这种情况少见；电镜观察证明了高渗液体灌注实验的结果。说明当缺乏T 的作用时，Sertoli细胞不能有效地构建起血睾屏障［22］。

2.附睾：70年代的研究已经证明，附睾的发育和功能完整有赖于T 的作用。胚胎期缺乏T，附睾不能发育；成年期去势，附睾重量下降、萎缩凋亡，管腔内精子消失。附睾AR 基因敲除小鼠（Prox-EARKO鼠），青春期后出现附睾头梗塞、无精子。显微镜下，附睾上皮高度缩短、主细胞胞浆减少、管腔内径增大、管间间隙扩大、睾丸液断流。一些标本可见精子壅塞。多数生精小管生精细胞消失，梗塞部位远端出现上皮内囊肿，管腔蓄积透明样物质。输出管、睾丸网和生精小管扩张，睾丸受压萎缩［23］。

3.生精细胞分化：异体移植研究发现，生精细胞具有种族特异性的内在程序，规范生精细胞增值和分化的时间和步骤。要成功地完成整个分化程序，即从精原细胞到精子，从Sertoli细胞基底部到管腔，最后释放精子，有赖于局部环境提供的信号和营养。Sertoli细胞与生精细胞之间的交流通过间隙连接（gap junction）、外胞浆特异化（ectoplasmic specialization）和管球复合体（tubulobulbar complexes）进行；Leydig细胞分泌T，以旁分泌方式影响Sertoli细胞的分化和功能。生精小管管周肌样细胞构建了生精小管的基板，维持睾丸内各种细胞之间的交流，调节生精小管的收缩运动和精子释放，管周肌样细胞AR 基因敲除（PTM-ARKO）小鼠的生精细胞全部消失，比SCARKO 小鼠的情况还要严重［24］。T 至少控制着生精细胞分化的四个阶段：精原细胞分化、减数分裂、精子细胞的分化和精子释放。用T 处理hpg.SCARKO 小鼠，可见睾丸容积增大、精囊重量增加、生精小管直径增大、出现管腔、部分生精小管出现精子发生、发育阶段可达圆形精子细胞。hpg.SCARKO 小鼠的血清FSH 水平显著低于正常，补充T 可使血清FSH 水平升高，许多情况下，T 可以独立启动精子发生，原因即在于T 在一定程度上可以诱导垂体分泌FSH［25］。

临床上，无论是睾丸原发性疾病（如Klinefelter综合征），下丘脑-垂体疾病（如Kallmann综合征，垂体前叶功能减退）或T 作用阻碍（雄激素不敏感综合征）的患者都没有生育能力。一部分少精子症或无精子症患者存在AR 基因突变，LH 和T 水平相对升高，而第二性征发育正常。AR 基因第一外显子CAG 重复序列的正常长度为9～36，超过正常范围可引起Kennedy综合征、X-连锁遗传、四肢近端肌肉进行性麻痹和萎缩、男子乳房发育和渐进性不育。即使CAG 重复序列长度在正常范围内，长度相对较短者雄激素效应强，相对较长者雄激素效应弱，并可出现精子发生障碍［26］。

4.精子释放：成熟的精子细胞与Sertoli细胞本体分离，释放进入生精小管管腔的过程称为精子释放。大鼠的精子释放始于精子发生的Ⅶ期，结束于Ⅷ期。释放进入管腔的精子很快到达附睾，其残余胞浆通过胞饮作用重新被Sertoli细胞吸收。这一过程在形态和结构上发生的关键变化是精子细胞胞浆和胞核的重塑，形成前精子细胞（spermatozoan），为脱离Sertoli细胞作好准备。同时，Sertoli细胞形成与前精子细胞联结的特异性外胞浆，它的向外延伸将前精子细胞逐步推向管腔［27］。外源性T注射通过抑制LH 的分泌而使睾丸内T 水平下降，从而抑制精子发生，这是T 作为男子避孕药的理论依据。男子接受T 避孕方案时，精子释放失败，精子细胞滞留并被Sertoli细胞吞噬［28］。

精子释放是一个复杂的过程，参与调节的激素有FSH、T、E2和催产素。成年大鼠阻断内源性FSH 和LH 后，约有50%的精子释放失败；用氟他胺阻断AR，约90%的精子不能释放［29］。外源性雌激素（100μg·kg-1·d-1，共10d）抑制了FSH 和睾丸内的T 水平，使睾丸内的雌激素水平升高5 倍，大鼠生精小管中Ⅶ期和Ⅷ期生精细胞的调亡增加，精子释放失败［30］。在精子释放过程的起始阶段，Leydig细胞合成和分泌催产素，刺激生精小管收缩，其作用在精子释放期达到高峰。转基因小鼠过度表达催产素可使精子释放提前；而缺乏催产素的小鼠精子释放延迟［31］。

六、雌二醇（E2）

人体内的雌激素包括E2、雌酮和雌三醇，以E2的作用最强，是体内的主导雌激素。男性血液中的E2的浓度很低，但在精液和睾丸网中的浓度高于女性血液浓度。睾丸内的E2是芳香化酶（CYP19）催化T 产 生，CYP19 存 在 于Leydig 细 胞、Sertoli细胞、精原细胞、精母细胞、长形精子细胞和精子的内质网中。目前的证据表明，主要是Leydig细胞产生E2，体外实验Sertoli细胞亦能合成E2。CYP19基因突变男子有青春期发育，第二性征正常，睾丸小或隐睾，生精细胞缺如，无精子或精子密度显著降低、死精子；T 水平正常或降低，E2水平＜1.5pg／ml（5.49pmol／L，正常范围36.6～146.4pmol／L），LH 和FSH 水 平 升 高，LH 脉 冲 频 率 增 高，E2补 充治疗后，LH 水平回复正常，FSH 仍高于正常［33］。

雌激素有两种受体，即ESR1（ERα）和ESR2（ERβ），属于转录因子家族核受体，E2与受体结合后，诱导核转录反应。此外，E2亦介导以秒或分计算的快速反应，这种快速反应有三种方式：（1）配体与位于胞浆膜附近的ESR1和ESR2结合，ESR 位于胞浆膜的机制未明；（2）ESR1 的剪接变异型，即ESR1-46 和-36；（3）G 蛋 白 偶 联 雌 激 素 受 体（GPER）或GPER30。这些快速反应的下游信号途径包括MAPK、磷酸肌醇-3-激酶（PI3K）、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）、cAMP和细胞内钙动员［34］。

在体外培养条件下，E2通过ESR1调节Sertoli细胞的增值。一方面激活GPER，上调BCL2／BCL2L2，保护细胞抵抗调亡；另一方面通过G-1-GPER／EGFP途径下调BAX 表达，降低调亡风险。说明E2通过不同分子信号途径的介导，维持精子发生过程中细胞增殖和调亡之间的平衡［35］。E2亦能迅速促进体外培养的精原细胞（GC-1 细胞系）的增殖［36］。

ESR1基因敲除雄鼠出生后睾丸正常，青春期后睾丸开始变性，成年期睾丸萎缩，精子发生障碍和精子密度显著降低，并不育；ESR2基因第3外显子缺失突变雄鼠由于受体后信号转导阻断，亦表现不育［34-36］。

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