星点设计-效应面法优化葛根素自微乳工艺

叶 蕾， 胡容峰，3*， 王晓华， 汤继辉

（1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230031； 2.安徽省中药研究与开发重点实验室， 安徽 合肥 230038；3.安徽省 “115” 现代中药研发创新团队， 安徽 合肥 230038； 4.安徽省医学科学研究院， 安徽 合肥230061； 5.安徽医科大学药学院， 安徽 合肥 230032）

星点设计-效应面法优化葛根素自微乳工艺

叶 蕾1，2， 胡容峰1，2，3*， 王晓华4， 汤继辉5

（1.安徽中医药大学，安徽 合肥 230031； 2.安徽省中药研究与开发重点实验室， 安徽 合肥 230038；3.安徽省 “115” 现代中药研发创新团队， 安徽 合肥 230038； 4.安徽省医学科学研究院， 安徽 合肥230061； 5.安徽医科大学药学院， 安徽 合肥 230032）

目的 研究制备葛根素自微乳处方。方法 通过考察葛根素在不同介质中的平衡溶解度以及伪三元相图的绘制，筛选出影响较大的因素并确定其范围，采用星点设计优化得到最终处方。结果 葛根素自微乳的处方为蓖麻油9%， 聚氧乙烯氢化蓖麻油 （RH40） 46%， 1，2-丙二醇 38%， 药物 7%。 结论 葛根素自微乳的粒径为 20.37 nm， 乳化时间为 42 s， 满足自微乳的要求， 处方可行， 可进一步研究。

葛根素； 自微乳； 星点设计-效应面优化法

葛根始载于 《神农本草经》， 具有解肌退热、生津透疹、升阳止泻的功能，主要用于外感发热、头痛、口渴、消渴、麻疹不透、热痢、泄泻、高血压颈项强痛。在葛根的有效成分中，以对葛根素的研究最受关注［1］。 它具有扩张外周血管， 降低血压，增加冠状动脉血流量，改善心肌缺血区的血流，降低心肌耗氧量，改善血流动力学指标等药理作用［2-3］。 葛 根 素在 防 治 冠 心 病［4］、 心 肌 梗 塞［5］、心律失常、高血 压病［6］、 动脉粥样硬化［7］等方面是较有发展前途的药物。

但葛根素溶解度小，口服生物利用度低，限制了其临床广泛应用。自微乳是由油相、乳化剂、助乳化剂组成，对于难溶性药物有着很强的增溶能力，口服后在胃肠道中可自发形成微乳。已有研究表明［8-9］， 微乳及自微乳 给药系统是难溶性 和难吸收药物的优良载体，可显著提高药物的口服生物利用度。本实验以葛根素为模型药物，制备葛根素自微乳的优化处方，为进一步研究开发新制剂奠定一定的基础。

1 仪器与试药

1.1 仪器 ML204 型电子天平 （瑞典 METTLER TOLEDO公司）； 85-2A型数 显 恒 温磁力搅拌器（江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）； Zetasizer Nano ZS90 纳米粒径电位分析仪 （马尔文仪器有限公司）； THZ-82A恒温气浴振荡器 （江苏金坛市金城国胜实验仪器厂）； 岛津高效液相色谱仪 （LC-20AB泵， SPD-M20A紫外检测器， 岛津 LC-solution色谱工作站） ； C18色谱柱 （ Global， 250 mm×4.6 mm， 5 μm）； UV-2550 型紫外分光光度计 （日本岛津公司）。

1.2 试药 葛根素原料药 （河南省宛西制药股份有限公司，批号 20120804）； 聚氧乙烯氢化蓖麻油（Cremophor RH40， 北京凤礼精求商贸有限责任公司）； 吐温 80 （天津市光复精 细化工 研究所，20080508）； 聚氧乙烯蓖麻油 （Cremophor EL， 德国 BASF， 59230975LO）； 聚乙二醇-12-羟基硬脂酸酯 （Solutol®HS 15， 北京凤礼精求商贸有限责任公司， 12428075LO）； 辛酸癸酸三甘油酯 （GTCC，英国 Croda公司， 19985）； 油酸乙酯 （ EO， 尉氏县香料厂， 鸣鹤香料样品）； 1，2-丙二醇 （北京凤礼精求商贸有限责任公司， T12121U）； 蓖麻油（天 津 市 大 茂 化 学 试 剂 厂）； 聚 乙 二 醇 400（ PEG400， 上 海 润 捷 化 学 试 剂 有 限 公 司，20120521）； 无水乙醇 （上海中试化工总公司）；甲醇 （色谱纯）； 其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 葛根素自微乳的处方前研究

2.1.1 葛根素的油水分配系数的测定 称取葛根素过量， 用蒸馏水溶解后滤过， 取续滤液20 mL以及等体积的正辛醇 （水饱和 24 h） 置于分液漏斗中， 盖紧塞子， 振摇 30 min， 静置 15 min， 分层后取水相置具 塞 试 管中， 3 000 r/min 离心 10 min，弃去油相， 用 HPLC测定药物质量浓度。 色谱条件为 C18色谱柱 （Global， 250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流动相甲醇-水 （25 ∶75）； 检测波长 250 nm； 进样量20 μL。

将上述剩余水相中的药物质量浓度定为 C2， 将原来水相中的药物质量浓度定为 C1。因为油相与水相为等体积， 根据公式 Papp= （C1-C2） /C2， 计算表观油 /水分配系数 （ Papp）， 结果显示 C1=70.75 μg/mL， Papp=0.504。 可知葛根素在水中的溶解度很小，表明葛根素水溶性差，且脂溶性也差。

2.1.2 葛根素在不同介质中的溶解度测定 取过量的葛根素分别加入到装有适量的油相、乳化剂、助乳化剂的具塞试管中，搅拌均匀后密封超声30 min，使药物均匀分布， 于 37 ℃气浴振荡 24 h，平衡后， 12 000 r/min 离心 10 min， 取上清液置量瓶中，精称一定量上清液，稀释到线性范围内，HPLC法测定溶解度。 结果见表 1。

由表1可知葛根素在不同油相中的溶解度很小， 顺序依次为蓖麻油 ＞EO＞油酸 ＞GTCC， 故油相确定为EO或蓖麻油。葛根素在不同乳化剂中的溶解度顺序依次为吐温 80 ＞RH40 ＞HS15 ＞EL。 葛根素在不同助乳化剂中的溶解度差别较大，其中在丙二醇中溶解度明显大于其他，故助乳化剂选择1，2-丙二醇。

表1 葛根素在不同介质中的溶解度Tab.1 Solubility of puerarin in differentmedia

2.2 葛根素自微乳的制备 将葛根素、 乳化剂、助乳化剂精密称定，依次加入具塞锥形瓶中，于37℃水浴下溶解， 混合均匀。 再加入精密称定的油相， 37 ℃水浴下混匀， 得到葛根素自微乳 （空白处方除葛根素不加外，其余步骤一样）。

2.3 初步处方的筛选

2.3.1 基质种类的筛选 通过溶解度的测定， 初步筛选出的基质进行配伍组合，配制不同比例的乳化剂与助乳化剂混合物， 按 “2.2” 项方法制备空白自微乳，滴定不同油相，以外观、静置后分层情况和乳化时间以及滴入水中颜色为评价指标，筛选处方组成。结果见表2。

表2 不同组分的处方评价Tab.2 Evaluation of the different com ponen ts of the prescription

由表2 中可知以 HS 15 为乳化剂的配方始终无法与蓖麻油或油酸乙酯形成稳定的自微乳体系，总出现分层。同时得出油相和乳化剂的组合为油酸乙酯和吐温 80， 或者蓖麻油和 RH40。

2.3.2 基质用量范围的筛选 将不同质量比的乳化剂与助乳化剂 （1 ∶3、 1 ∶2、 1 ∶1、 2 ∶1、 3 ∶1） 混匀后， 与油相按不同比例 （1 ∶9、 2 ∶8、 3 ∶7、 4 ∶6、 5 ∶5、 6 ∶4、 7 ∶3、 8 ∶2、 9 ∶1） 混合， 滴加入水中并观察。同时，采用绘制伪三元相图的方法，以选定的乳化剂与助乳化剂比例、油相和水各为一角，通过外观观察和体外乳化实验，确定微乳区界限， 绘制自微乳的区域， 如图1所示， 设 K m为乳化剂与助乳化剂的质量比，确定K m的范围。

由实验现象得知， 油相比例范围在 0 ～0.4之间。 同时 实 验 中发 现 EO-吐温 80-1，2 丙二 醇的 K m最小 只 能为 1 ∶2。由 EO-吐 温 80-1，2 丙二醇与蓖麻油-RH40-1 ，2 丙二醇伪三元相图结果发现，K m从小到大变化时，面积先变大后变小的趋势， 且在相同 K m值时， 蓖麻油与 RH40 的组合区域面积较大，所以优选基质为蓖麻油、cremophor RH40 和 1，2-丙二醇， 且确定 K m的范围在 1～3。

2.4 考察指标

2.4.1 自微乳成乳粒径大小 将按 “2.2” 项方法制备的不同处方自微乳用纯水稀释 100 倍， 用粒径测定仪测定微乳的粒径大小。

2.4.2 乳化时间 在烧杯中加入蒸馏水 100 mL，水温 37 ℃， 在搅拌速度 50 r/min 的条件下加入约1 g的自微乳，样品接触液面开始计时，目测自微乳的乳化时间。

2.4.3 平衡溶解度 将过量的葛根素加入到不同处方的空白自微乳中，密闭状态下于37℃气浴振荡 24 h， 平衡后， 12 000 r/min 离心 10 min， 取上清液置量瓶中，精称一定量上清液，稀释到线性范围内， HPLC法测定， 计算溶解度。

2.5 星点设计优化自微乳处方 在预实验的基础上， 采用油相百分比含有量 （X1） 及 K m （X2） 作为考察因素，根据星点设计的原理，各因素设置5水平， 用代码值 ±α， ±1， ±0 来表示，对于二因素的星点设计 α=1.414， 以粒径大小、 药物溶解度、乳化时间作为考察指标。 因素和水平见表3，实验结果见表4。

图1 不同配方比例的伪三元相图Fig.1 Pseudo-ternary phase diagram s of different formu lations

表3 因素及水平Tab.3 Factors and levels

采用 statistica 6.0 软件， 以乳化时间、 粒径大小、 平衡溶解度作为因变量， 分别对各因素 （自变量）各水平进行二项式拟合，方程式如下：Y1=91.155 4+391.625 X1-100.74 X2+1 813.77

X12+30.168 X22-211.99 X1X2（r=0.931 1）

表4 实验设计与结果 （， n=3）Tab.4 Results of central com posite design（， n=3）

表4 实验设计与结果 （， n=3）Tab.4 Results of central com posite design（， n=3）

自变量值序号因变量值X1 X2 粒径 /nm 乳 化时间 /s 溶解 度 /（ mg·g-1）1 -1 -1 18.55 ±1.73 17.3 ±1.5 78.32 ±1.15 2 -1 1 18.92 ±1.10 28.0 ±1.0 65.87 ±1.19 3 1 -1 127.57 ±2.12 316.7 ±3.8 41.83 ±0.51 4 79.36 ±2.01 250.0 ±5.0 22.84 ±1.53 5 -1.414 0 19.87 ±1.75 30.0 ±2.0 50.26 ±0.76 6 1.414 0 133.47 ±1.52 210.0 ±2.5 10.93 ±1.15 7 0 -1.414 54.58 ±1.05 105.0 ±2.1 59.92 ±0.64 1 1 8 1.414 31.97 ±1.01 58.3 ±1.5 50.75 ±0.76 9 0 0 29.21 ±1.63 76.0 ±2.0 53.68 ±0.80 0 10 0 0 29.30 ±1.65 75.0 ±1.0 53.48 ±0.58 11 0 0 29.10 ±1.70 75.0 ±2.0 53.88 ±0.59 12 0 0 29.22 ±1.73 80.0 ±2.0 53.68 ±0.64 13 0 0 29.18 ±1.70 80.0 ±2.0 53.68 ±0.60

Y2=56.078 2+49.055 4 X1-47.29 X2+1 233.7

X12+14.459 8 X22-123.56 X1X2（r=0.999 1）

Y3=93.493 3+98.731 5 X1-29.819 X2-466.2 X12+ 6.302 48 X22-16.114 X1X2（r=0.959 1）

Y1、 Y2、 Y3分别代表 乳化时间、 粒径 大小和平衡溶解度，以上数学模型为基础，描绘三维因变量 （response surface）， 绘制的三维效应面图， 结果见图 2。 并应用 SigmaPlot描绘各效应面的等高线图，如图3所示。由此综合分析得出处方为蓖麻油9%， 聚氧乙烯氢化蓖麻油为 46%，1，2-丙二醇为38%， 药物7%， 由最佳处方制备自微乳， 进行预测分析［10-13］。

图2 不同因变量的三维效应面图Fig.2 3D p redicted response surface

图3 不同因变量的等高线图Fig.3 Contour p lots of predicted response surfaces

图4 自微乳的粒径分布及电位Fig.4 Particle size distribution and the Zeta potential of puerarin self-m icroemulsion

2.6 优化处方的验证 根据预测的优化处方制备葛根素自微乳，目测法观察其外观，记下自微乳均匀分散成微乳时所需的时间。结果自乳化时间均小于 60 s， 澄清透明， 微见乳光。 并分别测定粒径、药物溶解度和乳化时间，将实测值与预测值做比较， 结果表明 （见表5）， 本实验所应用的星点设计-效应面优化具有较好的预测效果， 同时测得制得的自微乳粒径 20.37 nm， 电位 -25.5 mV， 稳定性较好 （结果见图4）。

表 5 星点设计-效应面优化法验证Tab.5 Verification of the central com posite design-response surfacemethodology

3 讨论

在自微乳处方筛选中，尽量选择对药物溶解度大的油相、乳化剂和助乳化剂，提高载药量。但在实际应用中需考虑各成分的刺激性以及相互之间的作用，所以本研究在测得溶解度的基础上进行了交互实验，直观地反映各成分的相互影响结果。

由于自微乳制剂中超过 40% （m/m） 的乳化剂，而服用大量的乳化剂有一定毒性；且本研究中发现，聚氧乙烯氢化蓖麻油用量过高时，加水稀释后形成凝膏，影响自乳化效率。因此，本研究中加入助乳化剂以提高乳化剂的乳化能力，减少乳化剂的用量。

在伪三元相图的绘制过程中观察到，自微乳体系滴加少量的水可形成油包水型微乳，表现为一种透明的油状液体，继续滴加水至一定量可出现玻璃状的凝胶态，再加水至一定比例时又会澄清，凝胶态消失，体系黏度减小，流动性良好，且带有淡蓝色乳光，我们认为此时形成水包油型微乳。

K m为乳化剂与助乳化剂的质量比，它对自微乳的形成及性质有较大的影响。不同K m值不仅影响粒子大小和液滴界面膜的强度，还能影响药效的发挥。 更重要的是乳化剂的用量影响着载药量［14］，因此，选择适当的K m尤为重要。 本研究并未就绘图中所取的几个点确定值，只是确定了它的范围，而精确的数值是通过后面的优化试验确定的，此方法避免了人为取点的干扰，得到的结果也更加有说服力。

粒径测定的稀释处理，参考了预试验中稀释倍数对于粒径的大小及电位有影响。自微乳稀释 100倍后无限稀释，对于粒径大小影响甚微，但继续稀释到一定倍数后， zeta电位太小， 体系稳定性差，综合分析后选择稀释100 倍测定。

大部分情况下，各因素对效应的影响并非线性，而目前普遍采用正交设计和均匀实际优化筛选处方，实验次数虽少，但精度不够，不宜采用非线性方程拟合实验结果和因素之间的关系，因此较难得出较佳的处方。本实验中采用的星点设计就是一种适合于非线性拟合的实验设计方法，该法遵循循序渐进的原则，根据球面设计原理确定数值和水平，提高优化效果。根据星点设计所建立的数学模型描绘效应面，将各效应面的等高线进行重叠，直观且方便的确定了较优处方。

本研究中确定的处方达到自微乳要求，按各辅料所占的比例计算载药量达到7%， 以此为基础，后期将球晶技术应用，进一步研究其液相中一步固化的工艺。

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Optim ization of puerarin self-m icroem ulsifying system using central com posite design-response surfacemethodology

YE Lei1，2， HU Rong-feng1，2，3*， WANG Xiao-hua4， TANG Ji-hui5
（1.Anhui University of Chinese Medicine， Hefei230031， China； 2.Key Laboratory of Research and Development of Chinese Medicine in Anhui Province，Hefei230038， China； 3.Anhui“115” Modern Traditional ChineseMedicine Innovation Team， Hefei230038， China； 4.AnhuiAcademy ofMedical Sciences， 230061， China； 5.College of Phamacy， AnhuiMedical University， Hefei230032， China）

puerarin； self-microemulsifying system；central composite design-response surfacemethodology

R944

： A

： 1001-1528（2014）03-0514-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.03.015

2013-06-14

国家自然科学基金项目 （81274100）； 安徽省高层次人才创新创业基金 （2009Z061）； 安徽省学术和技术带头人及后备人选科研活动经费资助项目 （皖人社秘 2011-381 号-26）

叶 蕾 （1988—） ， 女， 硕士生， 研究方向： 药物新剂型。 Tel： 13605696944， E-mail： 13605696944@163.com

*通信作者： 胡容峰， 女， 博士， 教授， 博士生导师， 研究方向： 药物新剂型。 Tel： （0551） 65169371， E-mail： hurongfeng@163.com