响应面法优选红豆杉枝叶中有效成分的提取工艺

吕佳佳， 李俊生， 王兴慧， 刘志辉

（1.南京中医药大学， 江苏 南京 210046； 2.南京中医药大学附属医院， 江苏 南京 210036）

响应面法优选红豆杉枝叶中有效成分的提取工艺

吕佳佳1， 李俊生1， 王兴慧1， 刘志辉2*

（1.南京中医药大学， 江苏 南京 210046； 2.南京中医药大学附属医院， 江苏 南京 210036）

目的 采用响应面法优选红豆杉枝叶中4种紫杉烷类有效成分的提取工艺。方法 选择乙醇体积分数、提取时间以及溶剂倍量为考察因素， 以紫杉醇、 7-表-紫杉醇、 7-表-10-去乙酰基紫杉醇、 10-去乙酰巴卡亭Ⅲ的量为评价指标， 计算总评 “归一值”， 并进行二项式拟合， 用效应面法优选提取工艺， 对结果进行预测分析。 结果 确定最优提取工艺为乙醇体积分数 71.32%， 18.6 倍量回流提取 2 次、 每次提取 0.82 h。 结论 采用响应面法得到的提取红豆杉枝叶中有效成分的工艺条件可靠，简单易行，对红豆杉枝叶中有效成分的提取具有一定的参考意义。

红豆杉；紫杉烷类；有效成分；响应面法；提取工艺

南 方 红 豆 杉 (Taxus chinensis var.mairei chenget L.K) 又称美丽红豆杉， 为国家一级保护植物， 是红豆杉科 (Taxaceac) 红豆杉属 (Taxus)植物中分布最广、生长最快的种类之一，研究证明红豆杉中紫杉醇能促进微管聚合，稳定微管结构，抑制微管解聚， 并将处于分裂期的细胞阻滞于 GZ/ M期， 诱导细胞凋 亡而达到抗肿瘤的 作用［1-3］。紫杉醇属于紫杉烷类，同为二萜类化合物，研究显示紫杉烷类也具有良 好的抗肿瘤作用［4-5］， 其 中含量较高的成分有紫杉醇、7-表-紫杉醇、 7-表-10-去乙酰基紫杉醇和 10-去乙酰巴卡亭Ⅲ。 目前已有学者对红豆杉中紫杉醇的含量及化学结构进行了研究［6］， 但紫杉烷类有效成分提取工艺尚未见报道。为了科学、充分地利用红豆杉资源，采用响应面法对影响有效成分的量的关键因素进行考察和优化，为大生产提供参考。

1 仪器与试药

Agilent1100 高 效 液 相 色 谱 仪:G1322A 脱 气机， G1311A 四 元 泵， G1316A 柱 温 箱， G1314A VWD检测器； R-Ⅱ旋转蒸发仪 (瑞典布琪公司)；DP-S24 型电热恒温水浴锅 (上海精弘实验设备有限公司)； 电子分析天平 (BP-211D型， 德国赛多利斯公司)等。

紫杉醇、7-表-紫杉醇、 7-表-10-去乙酰基紫杉醇对照品 (均购自中国药品生物制品检定所， 含量测 定 用， 批号 分 别为 100382-201102、 100927-201102、100925-200701)， 10-去 乙 酰 巴 卡 亭 Ⅲ(10-DABⅢ) 对照品 (购自四川省维克奇生物科技有限公司， 含量测定用， 批号为 120624)。 红豆杉枝叶购自无锡红豆集团药业有限公司 (批号20121025)， 测定用甲醇和乙腈为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 含量测定方法

2.1.1 色谱条件与系统适应性试验 Aglient C18色谱柱 (4.6 mm×250 mm， 5 μm)； 流动相以水为流动相A， 乙腈为流动相 B， 按下列洗脱程序进行梯度 洗 脱:0 ～16 min， 21% ～40%B； 16 ～50 min， 40% ～55%B；50 ～54 min， 55% ～56%；54 ～70 min， 56% ～65%B。 柱温 30 ℃；体积流量 1.0 mL/min； 检测波长 227 nm。

分别吸取 10-DABⅢ、 7-表-10-去乙酰 基 紫 杉醇、 紫杉醇、 7-表-紫杉醇混合对照品溶液#1、 供试品溶液各 10 μL，注入高效液相色谱仪， 测定，供试品与对照品在相同位置有吸收，分离度大于1.5， 理论塔板数按紫杉醇峰计不低于3 000， 见图1 ～2。

图 1 10-DABⅢ、 7-表-10-去乙酰基紫杉醇、 紫杉醇、 7-表-紫杉醇对照品色谱图Fig.1 Reference chromatogram of 10-DABⅢ， 7-table-10-deacetyl taxol， taxol and 7-table-paclitaxel

图2 供试品溶液色谱图Fig.2 Chromatogram of the test solution

2.1.2 对照品溶液的制备 分别精密称取 10-DABⅢ、 7-表-10-去乙酰基紫杉醇、 紫杉醇、 7-表-紫杉醇对照品 10.25、 10.03、 10.50、 10.57 mg于 4 个25 mL的量瓶中，甲醇定容至刻度， 摇匀， 即得质量浓度分别为 410、 401.2、 420、 422.8 μg/m L的对照品贮备液。 精密量取 10-DABⅢ贮备液 12 mL、7-表-10-去乙酰基紫杉醇贮备液 6 m L、 紫杉醇贮备液 8 mL、 7-表-紫杉醇贮备液 8 mL于 50 mL的量瓶中， 制备为混合对照品溶液#1。

2.1.3 标准曲线的绘制 分别精密吸取各贮备液适量， 加 甲 醇 稀 释 成 质 量 浓 度 分 别 为 9.84、19.68、 49.2、 68.88、 98.4 μg/mL的 10-DABⅢ系列 对 照 品 溶 液； 6.419、 12.84、 25.68、 38.51、64.19 μg/mL的 7-表-10-去乙酰基紫杉醇系列对照品 溶 液； 5.04、 10.08、 20.16、 35.28、 50.4 μg/mL的紫杉醇系列对照品溶液； 6.765、 13.53、27.06、 47.36、 67.65 μg/mL 7-表-紫杉醇系列对照品溶液。 按 “2.1.1”项下色谱条件测定， 以峰面积积分值为纵坐标、供试品质量浓度为横坐标绘制标准曲线，结果见表1。

表1 红豆杉枝叶中4种成分的标准曲线方程Tab.1 Standard curve equation of four com ponen ts in Yew foliage

2.1.4 精密度试验 取 10-DABⅢ、 7-表-10-去乙酰基紫杉醇、 紫杉醇、 7-表-紫杉醇混合对照品溶液1#，重复进样 6 次， 计算 10-DABⅢ、 7-表-10-去乙酰基紫杉醇、 紫杉醇、 7-表-紫杉醇对照品峰面积的 RSD分别为 0.58%、 0.73%、 0.60%、 0.59%。

2.1.5 加样回收率试验 取已知含量的红豆杉枝叶粉末 (含量分别为:10-DABⅢ为2.241 4 mg/g，7-表-10-去乙酰基紫杉醇为0.372 9 mg/g， 紫杉醇为0.332 7 mg/g，7-表-紫杉醇为0.432 8 mg/g) 约2.5 g， 6 份， 精密称定， 分别精密加入 10-DABⅢ对照品 (410.00 μg/mL)14 m L、 7-表-10-去乙酰基紫杉醇对照品 (401.20 μg/mL)2 mL、 紫杉醇对照品 (420.00 μg/m L)2 mL、 7-表-紫杉醇对照品 (422.80 μg/mL)3 mL， 按 “供试品溶液的制备” 项下方法制备供试品溶液， 测定， 测得 10-DABⅢ、 7-表-10-去乙酰基紫杉醇、 紫杉醇、 7-表-紫杉醇的平均回收率分别为:97.41%、96.25%、98.02%、 97.46%， RSD分别为 2.24%、 2.46%、1.85%、 2.59%。

2.1.6 供 试 品 溶 液 的 制 备 与 测 定 分 别 将“2.2.1、 2.2.2、 2.2.3、 2.2.4” 项下得到的提取液定容至 200 mL， 过 0.45 μm滤膜， 即得供试品溶液。分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液10 μL注入高效液相色谱仪， 测定， 计算。

2.2 提取因素和相关水平的选择

2.2.1 提取方法的选择 取红豆杉枝叶粉末 (80目)5 g， 分别以超声 (功率200W)、 回流 (电热套回流)、 温浸 (温度 50 ℃) 的方法进行提取，15 倍量的甲醇提取两次， 每次 1 h。 滤过， 合并两次提取液，按含量测定方法制备供试品溶液，测定， 结果见图 3(n=3)。

图3 不同提取方法对红豆杉枝叶中紫杉烷类有效成分提取效果的影响Fig.3 Effect of differen t extraction methods on the active com ponents of taxanes in Yew foliage

由结果可知，回流提取方法比超声和温浸提取的有效成分含量高，故选之。

2.2.2 提取溶剂的选择 取红豆杉枝叶粉末 (80目)5 g， 分别以甲醇、 30%、 50%、 70%、 95%乙醇为溶剂， 15 倍量回流提取两次， 每次 1 h。 合并提取液，按含量测定方法制备供试品，测定，结果见图4(n=3)。

图4 不同提取溶剂对红豆杉枝叶中紫杉烷类有效成分提取效果的影响Fig.4 Effect of different extraction solvents on the active components of taxanes in Yew foliage

如图所示，以甲醇和 95%乙醇为溶剂， 虽然7-表-10-去乙酰基紫杉醇、 紫杉醇、 7-表紫杉醇的量较高， 但 10-DABⅢ含有量较低； 而以 70%乙醇为溶剂对4个指标值均能达到较好的提取效果；随着乙醇体积分数降低，有效成分的提取率随之降低，考虑到多因素间的相互影响，选择乙醇体积分数的下限为 60%， 上限为 80%。

2.2.3 提取时间选择 取红豆杉枝叶粉末 (80目)5 g， 以15 倍量70%乙醇回流提取两次， 时间分别为 0.5、 1、 1.5、 2 h， 合并提取液， 按含量测定方法制备供试品， 测定， 结果见图 5(n=3)。

可知提取1 h后，有效成分含有量变化不大，考虑到多因素交互作用的影响，提取时间范围定为0.5 ～1.5 h。

图5 不同提取时间对红豆杉枝叶中紫杉烷类有效成分提取效果的影响Fig.5 Effect of d ifferent extraction time on the active ingredients of taxanes in the Yew foliage

2.2.4 溶剂倍量范围的选择 取红豆杉枝叶粉末(80 目)5 g， 分别加入 12、15、 18、 20、 22 倍量70%乙醇提取两次， 每次 1 h， 合并提取液并定容至 200 mL， 按含量测定方法制备供试品， 测定，结果见图 6(n=3)。

图6 不同溶剂倍量对红豆杉枝叶中紫杉烷类有效成分提取效果的影响Fig.6 Effect of different amounts of the solvents on the active com ponents of taxanes in Yew foliage

结果表明， 18 倍溶剂时提取量较高，大于 18倍增加不显著。从节约溶剂角度考虑，溶剂倍量范围定为16 ～20 倍。

2.3 响应面设计［7-9］

2.3.1 试验设计 单因素试验结果表明， 选取乙醇体积分数 (X1)、 料液比 (X2) 和提取时间(X3) 为自变量， 根据 Box-Benhnken 的中心组合实验设计原理对各因素进行3水平设计， 见表3，以10-DABⅢ (C1)、 7-表-10-去乙酰基紫杉醇 (C2)、紫杉醇 (C3) 和 7-表紫杉醇 (C4) 量作为评价指标， 实验设计方案及结果见表3， 提取次数定为2次。为了将所有指标综合为一个能反映总体效应结果的值， 实验中引入 “ 总评归一值” (overalldesirability， OD) ， 来考察指标的综合效果， 根据 Hassan 的方法对各个指标进行归一化处理。

对于欲测出各指标，其计算公式如式 (1):

其中， Yi为实测值， Ymin和 Ymax系 指 每 一指标在不同次试验中测得的所有值中的最小和最大值。计算出各指标的 di值后， 由式 (2) 计算 OD值:

表 2 Box-Behnken试验设计因素与水平的编码Tab.2 Cod ing of factor-levels in Box-Behnken design

表 3 Box-Behnken试验设计与结果Tab.3 Arrangement and results of Box-Behnken design

2.3.2 模 型 拟 合 将 所 得 数 据 用 Design-Expert 7.1.5 软件进行响应面试验分析，以 OD为响应值Y分别对各因素X(自变量)进行多元线性回归和二项式方程拟合， 回归方程为:Y=0.69+9.825 × 10-3X1-0.053X2+0.064X3-0.14X1X2+ 0.077X1X3-0.21X2X3-0.32X21-0.18X22-0.25X23。R2=0.978 6， adj-R2=0.9511。 方 差 分 析结 果 见表4。

表4 红豆杉枝叶有效部位提取工艺条件响应面拟合回归方程的方差分析结果Tab.4 Results of variance analysis of the fitting regression equation w ith the response surface for extraction conditions of the effective parts of Yew foliage

由方差分析结果可知，在本实验设定的区域范围内，提取时间和溶剂倍量对红豆杉枝叶有效成分的提取有显著影响，乙醇体积分数、提取时间和溶剂倍量的交互相对其有显著影响。回归方程失拟检验不显著，表明未知因素对试验结果干扰很小。拟合检验极显著，表明该方程与实际情况拟合很好，较好地反映了红豆杉枝叶紫杉烷类有效成分与乙醇质量分数、提取时间和溶剂倍量的关系，所得回归方程能较好的预测红豆杉有效成分随各参数的变化规律。由回归模型进行预测分析，OD最大预测值为 0.712， 最优条件为乙醇体积分数 71.32%， 溶剂倍量 18.6 倍、提取时间 0.82 h。

2.4 工艺验证试验

根据响应面法优选出的工艺条件，提取红豆杉枝叶粉末 3 份 (每份 5 g)， 进行工艺验证。 结果见表5。

表5 工艺验证试验 （n=3）Tab.5 Results of verification test（ n=3）

根据上述结果计算，二项式拟合方程预测值与实测值的偏差率 =(0.690 1-0.712)/0.712 × 100%=-3.08%，说明二项式拟合效果良好， 所建立的数学模型具有良好的预测性，所选工艺条件重现性较好。

3 讨论

紫杉醇在红豆杉类植物中的含量很低，目前产业用的紫杉醇多通过提取红豆杉中的紫杉烷类成分进行半合成。与根皮相比，枝叶中所含的成分与根皮大致相同，只是含量稍低，而枝叶因其不断地生长而可反复、循环利用，因而可较好地缓解红豆杉资源匮乏问题，保护生态。

相对于红豆杉中紫杉醇的提取工艺，目前国内学者对紫杉烷类化合物的提取工艺研究较少，特别是对其多个有效成分的提取尚未见报道，本实验采用响应面法优化提取工艺，兼顾了多个影响因素和多个参考指标，适用于非线性模型拟合，提高了数学模型的预测性，且结果较为理想。

红豆杉枝叶成分复杂，各有效成分的极性有所不同， 所研究的 4 种有效成分中 10-DABⅢ的水溶性较强，其余3种脂溶性较强，根据有效成分的性质选择适宜体积分数的乙醇热回流提取，能保证其提取率均达到较高水平。前期研究中，有进行石油醚脱脂，二氯甲烷萃取等步骤对比，最终发现经70%乙醇回流得到的提取液， 在不断调整流动相(乙腈和水) 梯度后， 进样分析。所得各成分峰的分离度与峰形均较好，该提取工艺简便高效，为其有效部位或成分的进一步开发利用提供了参考。

［ 1 ］ 骆泽宇.紫杉醇的药理与临床研究进展［J］.现代中西医结合杂志， 2006， 15(24):3457-3459.

［ 2 ］ 包怡红， 王 军.紫杉醇抗癌机理研究进展［J］.特产研究， 2003， 1(4):62-65.

［3］ 韩 锐，何小庆，刘红岩，等.紫杉醇的抗肿瘤作用、药理及药代动力学研究［J］.中国新药杂志， 1996， 5(4): 248-251.

［4］ 王建华，董 玫，张军芳，等.东北红豆杉中三种紫杉烷类化合物体外抗癌活性研究［ J］.中药药理与临床， 2008，24(4):27-28.

［5］ 舒琦瑾，李 萍，王彬彬.南方红豆杉水提物对人肺癌A549 细胞增殖抑制作用的研究［J］.中华中医药杂志，2011， 26(12):2982-2985.

［6］ 黄旭梁，刘开生，徐垒柱，高效液相色谱法测定南方红豆杉中紫杉醇的含量［ J］.现代中药研究与实践， 2010， 24 (4):60-62.

［7］ 李 晶，张洪霞，朱鸿敏，等.星点设计—效应面法优化升阳散火汤提取工艺［ J］.沈阳药科大学学报， 2010， 27 (5):392-397.

［8］ 常星洁，刘汉清，邹建荣，等.响应面法优化女贞子有效成分的提取工艺［J］.中成药， 2012， 34(5):839-842.

［ 9 ］ 李 航， 李小芳， 李 娜， 等.星点设计-效应面法优化黄连提取工艺［J］.中国实验方剂学杂志， 2012， 18(14): 52-55.

Optim ization of the extraction process of active com ponents in Yew foliage by response surfacem ethod

LÜJia-jia1， LI Jun-sheng1， WANG Xing-hui1， LIU Zhi-hui2*

(1.Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210046， China； 2.The Affiliated Hospital of Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210036， China)

Chinese yew； taxanes； active components； response surfacemethod； extraction process

R284.2

:A

:1001-1528(2014)02-0280-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.014

2013-04-15

江苏高校优势学科建设工程资助项目 (PAPD2011)

吕佳佳 (1988—)， 女， 硕士生， 从事中药新剂型与新技术研究。 Tel:15950566883

*通信作者: 刘志辉 (1962—) ， 男， 教授， 主任中药师， 从事中药制剂开发及中药质量标准研究。 Tel:(025)86529291， E-mail:liuzh1008@126.com