细菌线性质粒的复制研究

朱云霞 赵昕 张绮思 张海方

（江苏大学基础医学与医学技术学院，镇江 212013）

质粒是染色体外能够进行自主复制的遗传单位，广泛存在于许多生物中，习惯上用来专指细菌、酵母菌和放线菌等生物中染色体以外的DNA 分子，它们能为宿主提供一些额外的功能，如抗药性和毒力等，绝大多数的细菌质粒都是闭合环状DNA 分子。1979 年，在产抗生素的土壤微生物——娄彻链霉菌中发现了第一例原核生物线性质粒［1］，到目前为止，已在数十种链霉菌中发现了线性质粒，其分子大小在12-640 kb 之间［2］。1985 年，在疏螺旋体中发现了另一大类线性质粒［3］。近来有研究表明，细球菌属也有大线性质粒存在，这些红球菌的大线性质粒缺陷株对红霉素的抗性明显减弱［4］。线性质粒的发现纠正了所有细菌质粒都是环状结构这一传统观点。线性质粒作为一种特殊的质粒分子，成为近年来基础微生物学研究的一个新热点。关于线性质粒的结构、复制、遗传和生物学功能等方面虽然已有了一定的研究，特别是近几年在其复制的分子机制研究方面有了长足的进步，但距离科学开发和利用线性质粒还很远。

1 质粒复制的一般概述

质粒的复制和染色体的复制一样也可以分为起始、延伸和终止3 个阶段。其中复制的起始最为重要，主要包括复制起始点（oriV）的识别和复制起始复合物的装配［5］。复制起始位点一般都有一富A-T 区和多个重复序列（重复子）和DnaA 结合位点，质粒编码的复制起始蛋白Rep 和宿主细胞的复制起始蛋白如DnaA 等能以有序的方式与oriV 的重复子结合，从而促使双螺旋熔解形成开链复合体启动复制［5］。每个细胞中的质粒数即质粒的拷贝数在细胞里从单一到数千都有可能，质粒的拷贝数是受到多种机制严格控制的，是质粒本身的一种复制特性体现［5］。环状质粒的复制以θ 复制方式和滚环复制方式为主。θ 复制被认为是革兰阴性菌中质粒复制的主要方式，而滚环复制被认为是革兰阳性菌中质粒复制的主要方式。

2 线性质粒的复制

原核生物线性质粒的复制及其环状类似物的复制过程基本相同，而线性质粒则必需解决如何复制DNA 的3'最末端这个问题。因此，线性质粒的末端对其复制和稳定存在是必需的。原核生物线性质粒根据其末端结构的不同主要有两大类，一类其末端为共价闭合的发夹状结构；另一类其末端共价结合了蛋白质（末端蛋白）［6］。带有发夹末端的线性质粒虽然是双链线性分子，但其中一条链的5'和3'端分别与另一条链的3'和5'端直接连在一起；带有末端蛋白的线性质粒含有末端反向重复序列和末端蛋白。鉴于线性质粒的这些特殊的结构特征，线性质粒的复制在保留环状质粒复制过程中的基本规则外增添了许多自己的复制特点，如复制起始点的序列特征差异和线性质粒的独特的5'末端复制机制等［7］。

2.1 线性质粒的复制起始区

复制的起始是整个质粒复制的关键所在，因此线性质粒复制起始区的鉴定是研究某一线性质粒的复制机制的第一步。大量关于线性质粒复制起始区的鉴定等研究工作主要集中在链霉菌的线性质粒上。研究表明，大部分链霉菌线性质粒的复制起始区一般都只有一个，位于线性质粒的中部区域，其与环装质粒一样也有一富A-T 区和一些重复序列，但与环状质粒的复制起始区的序列特征会有所不同［8］。然而，2010 年，Zhang 等［9］在链霉菌属线性质粒pFRL1 中发现了两个复制起始区，一个位于质粒中心部位；另一个靠近质粒的一个末端，这两个复制起始区在复制起始过程中可能存在某种协作作用。因此，线性质粒的复制起始区可以只有一个，也可以有两个或两个以上，当有两个或两个以上的起始区时，它们可以在不同情况下执行各自的功能，这种机制还有待进一步研究。

不同物种遗传物质的复制起始区通常都具有相似性和保守性，如在复制起始区和终止区GC 含量会发生明显转折，因此对于线性质粒复制起始区的鉴定，可以利用序列比对分析和GC 含量偏移分析（GC skew）等生物信息学手段进行预测，然后设计试验加以验证［10，11］。

2.2 线性质粒的复制模型

2.2.1 具有共价闭合发夹末端的线性质粒复制模型 具有共价闭合发夹末端的线性质粒并不多见，主要见于疏螺旋体中的线性质粒。此外，只发现N15 原噬菌体质粒及奥克西托克克雷白杆菌的一个约50 kb 的线性质粒pKO2，以及小肠结肠炎耶尔森菌噬菌体质粒PY54［12-15］。这种以闭合发夹为末端的线性复制子的可能的复制方式有以下4 种［16-19］：（1）复制从内部起始区开始并沿着两个方向延伸至发夹末端，产生一个环状的二聚体，此二聚体带有连在一起的端粒序列，形成了反向重复区域，此反向重复区经端粒解离酶作用使得环状二聚体被切开，随后两条双链的末端又形成了共价闭合末端，复制得以完成；（2）复制起始于闭合的发夹末端，随着复制叉的移动形成了与第一种复制方式中相同的环状二聚体，后面的复制过程与第一种相同；（3）共价闭合的线性分子经特异性酶切后产生于两端产生对称的切口，使两条闭合的链被分开，形成线性不相连的双链结构，随后此双链结构被环化，利用DNA 聚合酶补齐缺口形成一个完整的环状分子，此环状分子由内部起始双向复制形成子代环状分子，再经特异性酶切回复线性结构，相应末端相连，形成两个共价闭合的线性分子，完成复制；（4）与第三种方式相似，共价闭合的线性分子首先经特异性酶切产生缺口形成黏末端的双链分子，接着短缺的3'末端由DNA 聚合酶按模板链补齐，随后每条链的末端发生重构形成折回结构，为子链复制提供了3'-OH，在DNA 聚合酶的作用下复制叉不断前移，最后形成两个共价闭合的线性分子。

2.2.2 具有末端蛋白结构的线性质粒复制模型 具有蛋白帽子末端结构的线性质粒主要来自放线菌，其典型的代表是链霉菌的线性质粒。研究表明，娄彻氏链霉菌中的线性质粒的复制是从内部起始区开始向两端进行的双向复制［20，21］。当新合成链5'末端的RNA 引物被切除后，就在5'末端产生了一个缺口，这一缺口的可能通过以下3 种不同的末端补丁机制来进行填补［22-26］。（1）折回模型。3'前导链的突出部分借助多拷贝回文序列与内部互补序列碱基配对形成茎环结构，末端蛋白经辅助蛋白招募至此3'末端并识别末端的复杂结构，随后DNA 聚合酶使用末端蛋白作为引物启动复制从而填补缺口；（2）重组模型。首先，在完整的父代双链分子末端以末端蛋白为引物合成了与前导链的5'端序列相同的DNA 序列，新合成的DNA 序列取代父代双链中前导链的5'端，被取代的带有末端蛋白的父代前导链5'端序列随后与子代悬突的3'端序列碱基互补配对，形成了一个半霍利迪交叉结构，从而通过同源重组完成了链置换，最后消除产生的半霍利迪交叉结构；（3）末端发夹模型。前导链3'末端的13 bp长的回文序列折回形成一个小的发夹结构，此发夹结构末端作为引物在DNA 聚合酶的作用下启动复制并填补缺口，随后末端蛋白结合于发夹结构的开始处并在此切断使前导链的3'端发生短缺，最后在DNA 聚合酶的作用下以新合成的完整后随链为模板从5'到3'方向填补好前导链3'端的短缺。

3 线性质粒pBSSB1 及其复制机制的研究现状

近年来，在伤寒沙门菌中也发现了线性质粒pBSSB1，该线性质粒是目前为止在肠杆菌科中发现的唯一线性质粒，其介导了H：z66 阳性伤寒沙门菌鞭毛的单向相变换［27，28］。pBSSB1 全长27 kb，共编码33 个基因，其中包括二相鞭毛素编码基因fljBz66和fljA 样基因。本实验室完成了fljBz66的表达调节机制研究和fljA 样基因对一相鞭毛素编码基因fliC 的抑制功能鉴定［29-31］。pBSSB1 两端为1.2 kb 左右的末端反向重复序列（Terminal inverted repeats，Tirs），Tirs 是链霉菌线性质粒所具有的结构特征，推测pBSSB1 与链霉菌属的线性质粒相似，可能也是具有蛋白帽子末端结构的线性质粒。通过对其序列比对分析和GC 含量偏移分析（GC skew），提示在它的第17 号编码基因的上游存在一个双向复制的起始位点［27］。此外，本实验室的研究表明，细菌基因组编码的Fis 蛋白可以影响该质粒的稳定性，推测其可能通过调控线性质粒复制必需的末端蛋白编码基因影响pBSSB1 的复制［32］。但目前为止，关于线性质粒pBSSB1 的复制机制还不甚清楚，如与质粒复制关系非常密切的该质粒拷贝数是否在细菌不同的生长时期有所变化，质粒上非常重要的复制起始点还未通过具体的实验加以验证确定，该线性质粒所编码的一系列基因与复制的关系等，这些问题都亟待研究解决，从而才能全面揭示该线性质粒复制的分子机制。

4 结语

虽然线性质粒的复制与环状质粒的复制有很多共性，但线性质粒复制有自己的特点。它最大的特点就是需要面对与真核生物染色体复制相同的问题：如何填补5'末端的缺口。具有蛋白帽子末端结构的线性质粒利用末端蛋白作为引物在DNA 聚合酶的作用下启动复制填补缺口；具有共价闭合发夹末端的线性质粒利用其闭合的末端避开了会产生缺口这一问题，在复制结束时利用端粒解离酶或其他特异性酶切开相连的末端再重新连接，恢复共价闭合的发夹末端。本文所提及的解决这一末端填补问题的每一个复制模型都有其合理性，是否还有其他复制模型存在还有待于进一步深入的研究加以揭示。

在具有蛋白帽子末端结构的线性质粒复制模型中，末端蛋白发挥了重要作用。虽然很多线性质粒本身具有末端蛋白的编码基因（tpg），但也有一些小的质粒本身没有tpg，需要借用宿主染色体编码的末端蛋白来完成复制。已有研究发现，一些线性质粒本身编码或宿主染色体编码的末端辅助蛋白可以招募宿主染色体编码的末端蛋白，从而完成自身的复制［33］，这其中的机理还有待研究。同时，线性质粒在复制过程中是否会通过整合到宿主染色体上，利用宿主的资源完成自身复制后再独立出来，即线性质粒的复制与宿主染色体复制之间的联系还有待研究。

另外，研究表明有一些链霉菌属的线性质粒末端序列缺失后，其两端可融合并以环状形式复制［9］，因此这些末端序列是维持质粒以线性形式复制的必要元件；既然线性质粒在一定情况下可以环状形式复制，这种线性复制与环状复制的转换是否也会发生在自然条件下还有待研究。

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