化瘀通络健盘贴的质量标准研究

孟 灿 陈随清 张培培

（河南中医学院，河南 郑州 450046）

化瘀通络健盘贴的质量标准研究

孟 灿 陈随清 张培培

（河南中医学院，河南 郑州 450046）

目的制定化瘀通络健盘贴的质量标准。方法采用薄层色谱（TLC）法对处方中乳香、没药和血竭进行定性鉴别；采用高效液相色谱（HΡLC）法对血竭中的血竭素进行含量测定。结果薄层色谱专属性强、斑点清晰、分离度好；血竭素进样量在0.130～0.455 μg范围内具有良好线性关系，回归方程为：Y=5557853187X-49712，r=0.9997；加样回收率平均值为98.49%，RSD为1.61%（n=6）。结论该方法简便、检测灵敏度高、重现性好，可用于化瘀通络健盘贴的质量控制。

化瘀通络健盘贴；薄层色谱鉴别；高效液相色谱法；血竭素；质量标准

化瘀通络健盘贴主要由乳香、没药、血竭、青风藤、麻黄、全虫、细辛、千年健、独活等13味药材组成，具有补肾健骨、行气活血、通络止痛之功效，临床用于治疗颈、腰椎间盘突出症等引起的颈、腰以及上下肢疼痛麻木等。为了进一步控制化瘀通络健盘贴的质量，确保临床用药安全有效，本文采用薄层色谱法对处方中血竭、乳香、没药3味药材进行定性鉴别，并以血竭中的血竭素作为定量指标，采用HΡLC法进行含量测定，为有效的控制该贴剂的质量提供科学合理的依据。

1 仪器与试药

1.1 仪器

水浴锅DK-S26（上海精宏实验设备有限公司），十万分之一分析天平BT25S（赛多利思科学仪器），高效液相色谱仪e2695-2998（美国waters公司）；电热恒温鼓风干燥箱DHG-9053A （上海市医用恒温设备厂），高速粉碎机XIA-100A（姜堰市银河仪器厂），循环水式多用真空泵SHZ-95B（巩义市予华仪器有限责任公司），自动双重纯水蒸馏器SZ-93（上海亚荣生化仪器厂）。

1.2 试药

血竭素对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110811-200704）；化瘀通络健盘贴及相应阴性样品均由河南中医学院第三附属医院提供；实验中所用药材均于郑州市张仲景大药房购买，由河南中医学院陈随清教授鉴定全部符合2010版《中国药典》（一部）相关规定；硅胶GF254（上海亨代劳商贸有限公司），乙腈（色谱纯），双蒸水，其余所用试剂为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 乳香的薄层鉴别：取本品3.0 g，置具塞锥形瓶中，加正己烷10 mL，超声震荡15 min，滤过，滤液作为供试品溶液。按处方配比和制法，制备缺乳香的阴性样品，按照供试品制备方法制得乳香阴性对照样品溶液。另取乳香对照药材0.2 g，置具塞锥形瓶中，加正己烷10 mL，超声震荡（功率：250 W，频率100 kHz）15 min，过滤后滤液作为对照药材溶液。吸取供试品溶液、阴性对照样品溶液、对照药材溶液各5～10 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，展开剂为石油醚—乙酸乙酯（5∶1），展开后取出，晾干，以5%茴香醛硫酸溶液为显色剂，100 ℃加热10 min至斑点显色清晰。最后，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的荧光黄斑点，而阴性对照样品色谱在与供试品色谱和对照药材色谱相应的位置上无对应斑点。见图1。

图1 乳香薄层色谱照片及色谱图

2.1.2 没药的薄层鉴别： 取本品6.5 g，置具塞锥形瓶中，加入40 mL乙醇溶解，超声震荡（功率：250 W，频率100 kHz）30 min，过滤后将滤液蒸干，加2 mL乙醇溶解残渣，作为供试品溶液。按处方配比和制法，制备缺没药的阴性对照样品，同法制备阴性对照样品溶液。再取没药对照药材0.4 g，置具塞锥形瓶中，按照供试品制备方法制得没药对照药材溶液。照薄层色谱法（《中国药典》2010版一部附录ⅥB）[1]试验，吸取供试品和阴性对照样品溶液各4 μL以及对照药材溶液2 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，层析条件为三氯甲烷—乙酸乙酯（80∶1），展开后取出，晾干，以5%茴香醛硫酸溶液为显色剂，105 ℃加热10 min至斑点显色清晰。供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同的紫红色斑点，而阴性对照样品色谱在与供试品色谱和对照药材色谱相应的位置上无对应斑点。见图2。

2.1.3 血竭的薄层鉴别：取本品2.0 g，加入10 mL乙醚，密塞并振摇10 min，过滤后将滤液作为供试品溶液。按处方配比和制作工艺，制备缺血竭的阴性样品，按照供试品制备方法制得阴性对照样品溶液。另取血竭对照药材0.1 g，同法制得血竭对照药材溶液。再取血竭素高氯酸盐对照品加甲醇制成每1 mL中含血竭素26 μg （血竭素重量等于血竭素高氯酸盐重量/1.377）的对照品溶液。吸取上述4种溶液各15 μL，分别点于同一硅胶GF254薄层板上，层析条件为三氯甲烷-甲醇（19∶1），展开后取出，晾干，置日光灯下观察。结果，在与对照品和对照药材溶液相对应的位置上，供试品溶液显相同的橙色斑点，且阴性对照样品无干扰。见图3。

图2 没药薄层色谱照片及色谱图

图3 血竭薄层色谱照片及色谱图

2.2 HΡLC法测定血竭素的含量

2.2.1 色谱条件：色谱柱：Agilent Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm， 5 μm）；流动相：乙腈—0.05 moL/L磷酸二氢钠溶液（52∶48）；检测波长：440 nm；流速：0.8 mL/min；柱温：38 ℃；进样量：10 μL，在上述色谱条件下，血竭素与其他成分色谱峰分离度良好，阴性样品无干扰。理论塔板数按血竭素峰计算不低于4000。结果见图4。

图4 化瘀通络健盘贴中血竭素的HΡLC图

2.2.2 供试品溶液的制备：取本品适量，除去盖衬，剪成小块，取0.15 g，精密称定，置具塞试管中，精密移取10 mL 3%磷酸甲醇溶液，密塞并振摇3 min，过滤后精密量取续滤液1 mL，加甲醇溶液定容至5 mL棕色量瓶，摇匀，即得。

2.2.3 对照品溶液的制备：精密称取减压（五氧化二磷）干燥24 h的血竭素高氯酸盐对照品1.8 mg，加3%磷酸甲醇溶液定容至10 mL棕色量瓶，摇匀，精密移取1 mL，加甲醇溶液定容至5 mL棕色量瓶，摇匀，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备[2,3]：按处方的配比和制法，制备缺血竭的阴性对照样品，精密称定，照供试品溶液的制备方法制成阴性对照溶液。

2.2.5 线性关系考察：精密吸取血竭素高氯酸盐对照品溶液（0.026 mg/mL）5.0、7.5、10.0、12.5、15.0、17.5 μL进样，横坐标：进样量（x，μg），纵坐标：峰面积积分值，绘制标准曲线得回归方程为Y=5557853187X-49712（r =0.9997）。结果表明，血竭素进样量在0.130～0.455 μg范围内具有良好线性关系，见图5。

图5 血竭素标准曲线图

2.2.6 精密度试验：精密吸取对照品溶液10 μL，按上述色谱条件连续进样6次，计算得到血竭素峰面积的RSD为2.38%，表明仪器具有良好的精密度。

2.2.7 稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液10 μL，分别按照“2.2.1”项下条件于0、2、4、6、8、10、14 h进样测定。结果，RSD为2.74%＜3%，表明供试品溶液在14 h内稳定。

2.2.8 重复性试验：取同一批样品适量，共5份，分别按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，按上述色谱条件分别进样测定。计算其峰面积的RSD=1.36%，表明所建立的方法重复性良好。

2.2.9 加样回收率试验：称取已知血竭素含量的同一批样品适量，共6份，精密称定，加入质量浓度为0.026 mg/mL的血竭素高氯酸盐对照品5 mL，按“2.2.2”项下的方法制备所需供试品溶液，分别按照“2.2.1”项下条件进样测定，计算加样回收率。结果求得血竭素平均加样回收率为98.49%，RSD=1.61%。见表1。

表1 加样回收率试验结果

2.2.10 样品含量测定：取5批化瘀通络健盘贴样品，分别按“2.2.2”项下方法制成供试品溶液，进样测定峰面积，用外标一点法计算血竭素含量。结果见表2。

3 讨 论

由于该处方有13味药材组成，药味较多，采用薄层色谱法对贴剂中各味药材分别进行了定性鉴别，但因为阴性干扰较为明显，处理方法相对复杂，所以只对乳香、没药、血竭3味药材进行的薄层色谱鉴别，并且其分离度好、重现性强、阴性无干扰，故采用本文的方法对该方中此3种药材进行薄层鉴别。

处方中血竭为化瘀通络健盘贴的君药，故对血竭中的血竭素进行含量测定。查阅相关文献发现HΡLC法测定血竭中血竭素的含量通常采用不同比例的乙腈-0.05 moL/L磷酸二氢钠溶液为流动相[4,5]，故本试验对流动相的配比进行了考察，实验结果表明乙腈—0.05 moL/L磷酸二氢钠溶液（52∶48）为流动相时，峰分离效果最好，峰面积最大，保留时间最短，且峰形较好。此外，根据药典对单味药血竭的检测，采用440 nm作为检测波长，结合3D色谱图，发现在440 nm时，峰分离度好，且峰形对称，故选其为最佳波长。综上，本文所建标准能够有效控制本品质量。

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典[M].北京:化学工业出版社,2010:554-556.

[2] 王杰,吴贵华,吕曙华.HΡLC法测定红花七厘散中血竭素高氯酸盐[J].中草药,2006,37(6):859-860.

[3] 张斌,王丽娜,麻风华,等.高效液相色谱法测定骨复康胶囊中血竭素的含量[J].中国实验方剂学杂志,2003,9(3):16-17.

[4] 李长达.安阳固本膏中血竭素的HΡLC含量测定[J].中国现代药物应用,2012,6(19):119.

[5] 张晓燕,刘敏臣,高菲,等.HΡLC法测定血竭胶囊中血竭素的含量[J].中国医药导刊,2009,11(2):297.

Quality Standard Research of Huayu Tongluo Jianpan Stickers

MENG Can, CHEN Sui-qing, ZHANG Pei-pei
(Henan University of Traditional Chinese Medicine, Zhengzhou 450046, China)

ObjectiveTo formulate Huayu Tongluo Jianpan Stickers to the quality control stan-dards.MethodsTo use thin layer chromatography to identify the Frankincense、Myrrh and Dragon's blood. Use high performance liquid chromatography method for the determination of dr-acorhodin content.ResultsThe TLC is a feasible method with strong specificity, TLC spots were clear and good separation;Dracorhodinin 0.130～0.455 μg has a good linear relationship. The regression equation is Y=6E+09X-49712, r =0.9997. Average sample recovery rate was 98.49%, RSD was 1.61%(n=6).ConclusionThe method is simple, high detection sensitivity,good reproducibility,and can be used for quality control of Huayu Tongluo Jianpan Stickers.

Huayu Tongluo Jianpan Stickers; TLC; HΡLC; Dracorhodin; Quality standard

R284.1

B

1671-8194（2014）10-0008-03

河南省科技创新人才计划资助项目（编号：114200510014）

*通讯作者:E-mail: suiqingchen@sohu.com