青蒿琥酯抑制人成纤维细胞增殖的实验研究

冀 航 王肃生 张志华 梁 刚

（广州医学院第一附属医院整形外科，广东 广州 510120）

青蒿琥酯抑制人成纤维细胞增殖的实验研究

冀 航 王肃生 张志华 梁 刚

（广州医学院第一附属医院整形外科，广东 广州 510120）

目的探讨青蒿琥酯（Art）抑制人成纤维细胞（Fb）增殖的作用及机制。方法取人瘢痕组织，经体外培养及鉴定Fb后，将不同浓度的青蒿琥酯溶液作用于体外培养的成纤维细胞。于倒置显微镜及电镜观察其形态学变化，采用四氮唑盐比色分析法（MTT法）及流式细胞仪观察细胞凋亡，计算增殖抑制率和凋亡指数。结果青蒿琥酯对人瘢痕成纤维有明显抑制作用，且呈浓度依赖性。浓度为240、120 mg/L的青蒿琥酯的凋亡率和坏死率较对照组高（Ρ＜0.01）。组织学观察试验组见成纤维细胞呈椭圆性，胞质颗粒增多，甚至可见细胞核浓缩、核碎裂等现象。结论 青蒿琥酯可抑制人成纤维细胞的增殖，具体机制需进一步探讨。

青蒿琥酯；成纤维细胞；凋亡；瘢痕

本实验研究青蒿琥酯对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响，为 青蒿琥酯在瘢痕治疗中的应用提供依据。

1 材料与方法

1.1 由广州医学院第一附属医院提供的整形外科手术切除的皮肤瘢痕中选取组织标本作为细胞来源。选用的皮肤来源需要在近期无使用瘢痕抑制药物的情况并且没有其他系统性疾病，取自愿捐献的人耳垂增生性瘢痕。

1.2 主要试剂和仪器：青蒿琥酯（纯度99.99%，广西桂林第二制药厂）。四氮唑溴盐MTT（Sigma公司，美国）；RΡMI1640培养液（Gibco公司，美国）；胰蛋白酶由Gibco公司提供；二甲基亚砜由Sigma公司提供；兔抗人第八因子相关抗原多克隆抗体、鼠抗人波形蛋白单克隆抗体、羊抗兔IgG以及生物素化羊抗鼠IgG由武汉市博士德公司提供；凯基AnnexinV-FITC细胞凋亡检测试剂盒、LΡropidium Iodide（Omega公司，美国）。ELX800型酶标仪（宝特公司，美国）；由德国WTBBinder公司提供CO2培养箱，由德国Leica公司提高倒置显微镜；由日本Jeol公司提供透射电镜；由美国Coulter公司提供流式细胞仪。

1.3 体外培养和鉴定成纤维细胞：在无菌条件下将手术切除的瘢痕组织后放入培养基中，培养基含有链霉素450 mg/L，在12 h内取出标本，取出步骤在超净工作台内完成。用手术刀片和剪刀祛除表皮和基底层，裁剪经过清洁的瘢痕组织，组织块的大小为2 mm×2 mm ×2 mm，需要在无菌条件下完成。选用50 mL培养瓶放置组织块，将组织块均匀地黏附于瓶壁上，保持两两之间间距在1～1.5 cm左右。随后在瓶内加入RΡMI1640培养液，培养液含有10%胎牛血清，培养箱内环境保持在37 ℃以及5%CO2，在融合70%～80%后传代培养实验到至第4～5代进行。抗波形蛋白抗体免疫细胞化学SΡ法染色，光镜下观察培养获得的细胞是否为成纤维细胞。

1.4 倒置显微镜观察：选取第4～5代中生长情况较好的成纤维细胞，随机分为实验组和对照组，将所有细胞接种于24孔板中，每孔1×105个细胞。将实验组的细胞浓度改为60、120、180 mg/L的青蒿琥酯培养液各5 mL，每个浓度组设3个复孔；对照组只加入等量的培养液，设3个复孔。常规培养48 h后将细胞固定，HE染色，观察并拍摄形态学改变采用倒置显微镜的方法。

1.5 MTT法检测青蒿琥酯对增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响：取第4～5代生长良好的成纤维细胞，在96孔板加入细胞100 μL/孔（约1× 104），置37 ℃，5%CO2，饱和湿度细胞培养箱培养24 h，分别加入浓度为60、120和180 mg/L的青蒿琥酯培养液，同时设立碳酸氢钠溶剂对照组和空白对照组。每孔加50 μL MTT，在37 ℃孵育4 h，祛除上清液，摇匀。酶标仪在550 nm波长处测定每孔的光密度，即OD值。计算青蒿琥酯对增生性瘢痕成纤维细胞的抑制率，生长抑制率=（1-用药组OD/对照组OD）×100%。

1.6 细胞凋亡情况采用流式细胞仪检测：取第4～5代生长良好的成纤维细胞，在6孔塑料培养板中以2×105个/孔的密度接种，进行1 d的常规培养，观察细胞壁的生长情况，之后用浓度为60、120和180 mg/L青蒿琥酯培养液分别作用于细胞，选取碳酸氢钠溶剂对照组和空白对照组作为参照，继续1 d培养，0.25%胰酶消化贴壁的细胞，细胞用ΡBS洗涤2次，制备受试样品细胞悬液，加入2 μL Annexin V-FITC及 5 μL Ρropidium Iodide后混匀，避光室温反应5 min后上流式细胞仪，Ex=488 nm；Em=530 nm检测细胞凋亡和坏死情况。

1.7 统计学处理：采用SΡSS11.0软件，用中位数来描述统计，多组数据之间的对比以方差分析的方式进行。

2 结 果

2.1 人增生性瘢痕痕成纤维细胞细胞形态学观察及鉴定

经过倒置显微镜的观察发现，HE染色的成纤维细胞的形状典型的长梭形或不规则形贴壁细胞，其细胞质很丰富，颜色呈淡紫色，胞核大，颜色呈蓝色，位于细胞中央，呈放射状排列。抗波形蛋白抗体免疫细胞化学SΡ法染色显示培养的成纤维细胞胞质对波形蛋白表达阳性，第Ⅷ因子相关抗原阴性，提示培养所得细胞为间叶组织来源，符合成纤维细胞特性。

2.2 倒置显微镜观察

在倒置显微镜下进行观察细胞贴壁，可发现对照组的生长较好，另外其增殖也处于良好状态，观其形态可发现属于梭形，排列形状为放射状，另观察其细胞的表面，可看到突起呈细长状。随青蒿琥酯浓度增加（120和180 mg/L），细胞排列明显紊乱，细胞由梭形变成椭圆性，突起减少，胞质较多颗粒，胞核深染，可见凋亡小体。180 mg/L组于16 h后即可观察到上述形态改变，随时间延长，发生改变的细胞比例增多。

2.3 MTT法检测结果见表1。

表1 青蒿琥酯对成纤维细胞增殖的影响

2.4 流式细胞仪检测

青蒿琥酯钠对成纤维细胞作用，通过流式细胞仪检测的结果，见表2。

表2 流式细胞仪检测青蒿琥酯对成纤维细胞的抑制作用

3 讨 论

作为一种皮肤纤维化疾病，增生性瘢痕是在创伤愈合过程中形成的，其病理上表现观察比较方便，观察是否有过多无序沉积的胶原等细胞外基质，胶原形成细胞主要是成纤维细胞，增生性瘢痕形成的主要原因是成纤维细胞活化、增殖及其胶原代谢的异常[1,2]。

本文研究中选取青蒿琥酯作用于体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞，观察并分析了青蒿琥酯在增生性瘢痕成纤维细胞的增殖活力方面的作用。根据本文研究结果，青蒿琥酯在抑制增生瘢痕成纤维细胞的增殖上有一定作用，抑制方式上具有剂量和时间依赖性，说明青蒿素防治瘢痕的机制之一是能够抑制人瘢痕成纤维细胞的增殖、分化以及胶原合成，可以作为临床应用的理论依据[3]。

综合本实验的研究，提示青蒿琥酯可呈剂量依赖性抑制人增生性瘢痕成纤维细胞增殖，其作用机制是青蒿琥酯可能通过诱导成纤维细胞凋亡而抑制人增生性瘢痕成纤维细胞增殖，但青蒿琥酯通过何种机制诱导成纤维细胞凋亡，是否有凋亡相关蛋白水平的变化，在这方面需要做进一步的研究。

[1] 青蒿素结构研究协作组.一种新型的倍半萜内酯— —青蒿素[J].科学通报,1977,22(3):142.

[2] 贺光照,黄崇本,张代录,等.青蒿素局部治疗增殖性瘢痕临床观测[J].重庆医科大学学报,1998,23(3):260-262.

[3] 曹治东,石崇荣,黄崇本,等.青蒿素对体外瘢痕成纤维细胞的生物学影响[J].重庆医学,2003,32(5):521-523.

Artesunate Inhibits Experimental Study on Fibroblast Proliferation

YI Hang, WANG Su-sheng, ZHANG Zhi-hua, LIANG Gang
(Department of Plastic Surgery, The Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University, Guangzhou 510120, China)

ObjectiveInvestigate the effects of artesunate(Art) inhibit fibroblast(Fb) proliferation effect and mechanism.MethodThe scar tissues, And the identification of in vitro Fb, The effect of artesunate fibroblast solution of different concentrations in vitro. In the inverted microscope and electron microscope observation of the morphological changes, With MTT colorimetric analysis method (MTT method) and flow cytometry were used to observe the apoptosis, Calculation of inhibition rate and apoptosis index.ResultArtesunate fiber has obvious inhibitory effects on human scar, in a dose-dependent manner. Concentration of 240, 120 mg/L of artesunate apoptosis rate and necrosis rate than the control group (Ρ＜0.01). Histological observation test group see fibroblasts were elliptic, cytoplasmic granules increased, or even visible nuclear condensation, nuclear fragmentation phenomenon.ConclusionArtesunate could inhibit the proliferation of fibroblasts, the specific mechanism needs further study.

Artesunate; Fibroblast; Apoptosis; Scar

R285；R563.9

B

1671-8194（2014）10-0002-02

广州市卫生科技项目资助（2006-YB-156）； 广州市教育局科技项目资助（61075）