SARS冠状病毒病毒样颗粒疫苗的研究进展

孟娟丽，沈晓玲，谭文杰

1.内蒙古医科大学 基础医学院微生物学教研室，内蒙古 呼和浩特 010110；2.中国疾病预防控制中心 病毒病预防控制所，北京 102206

冠状病毒（coronavirus，CoV）是一类有包膜的单股正链RNA病毒，宿主范围广泛，人和多种动物普遍易感，与人和动物的许多疾病有关。有4种普遍流行的人冠状病毒[1]，包括HCoV-OC43、HCoV-229E、HCoV-NL63和HCoV-HKU1，主要引起普通感冒症状。除此之外，2003年暴发的SARS-CoV和2012年9月新鉴定的MERS-CoV均属于高致病性人冠状病毒[2-3]，常导致严重呼吸窘迫综合征，有较高的病死率。2003年自中国暴发的严重急性呼吸综合征（severe acute respiratory syndrome，SARS）波及30多个国家，导致约8000人感染，其中700余人死亡，病死率约10%。2005年以来未见新的感染病例报道，但多种研究证据表明SARS-CoV来源于动物，再次发生跨种属传播的可能性依然存在。

目前尚无治疗SARS-CoV感染的特效抗病毒药物，故研制安全有效的SARS疫苗，开展人群特别是高危人群免疫接种是较好的防控措施之一。目前已报道的SARS-CoV疫苗包括灭活疫苗、基因工程亚单位疫苗、DNA疫苗、病毒载体疫苗和病毒样颗粒（virus-like particles，VLP）疫苗[4]。其中VLP疫苗是由某种病毒的一个或多个结构蛋白组成的不含病毒基因组的空心颗粒，因此不能自主复制，不具有感染性。VLP疫苗较灭活疫苗或减毒活疫苗更安全，同时较亚单位疫苗或DNA疫苗的免疫原性强，因此，SARS-CoV VLP很有潜力成为候选应用疫苗。我们对SARS-CoV VLP疫苗的组成、制备与应用简要综述如下。

1 SARS-CoV结构蛋白及VLP疫苗的组成与免疫特性

SARS-CoV基因组全长约27 kb，由14个开放读框组成。其中5个开放读框是所有已知的冠状病毒都具有的，分别编码复制酶1a/1b、S蛋白、M蛋白、E蛋白和N蛋白；其余的8个开放读框编码大小为39～274个氨基酸残基的辅助蛋白（3a、3b、6、7a、7b、8a、8b、9b），是SARS-CoV所特有的，与其他冠状病毒辅助蛋白的氨基酸序列几乎无同源性[4]。S蛋白、3a蛋白、M蛋白和E蛋白是SARS-CoV的包膜蛋白，位于病毒表面，理论上都能产生中和性抗体保护机体。研究表明，S蛋白和3a蛋白在体外均能诱导中和性抗体[5]；S蛋白和N蛋白共同引起较强的免疫反应，但被动转移研究表明S蛋白是保护性免疫的主要抗原，仅S特异性抗体能阻止SARS-CoV在小鼠模型中复制[6]。

S蛋白是SARS-CoV最大的结构蛋白，属于Ⅰ型跨膜蛋白，是冠状病毒感染细胞的重要蛋白，决定其感染的种属特异性和组织嗜性。同时，S蛋白也是产生中和性抗体和细胞免疫反应的主要靶抗原[5]。S蛋白S1区的受体结合区（RBD）包含多种构象中和表位，与血管紧张素转换酶2（ACE2）受体结合，介导SARS-CoV进入宿主细胞。S蛋白是高度糖基化蛋白，主要抗原表位的抗原性依赖于蛋白构象和糖基化，故S蛋白适合在真核系统中表达。

M蛋白是SARS-CoV最大的跨膜蛋白，包含3个跨膜区，大部分位于包膜内与N蛋白结合，仅N端N-糖基化小部分位于包膜外。M蛋白的3个跨膜区都参与M蛋白的自我组装与亚细胞定位，其中第一个跨膜区最重要[7]，缺失突变M蛋白的跨膜区影响M蛋白的亚细胞定位[8]。糖基化方式不影响M蛋白的定位、自我组装及释放。

E蛋白属于Ⅱ型跨膜蛋白，至少包含1个跨膜区，相对分子质量约为10 000，仅在病毒包膜及感染细胞表面少量表达。不论在体内或体外，E蛋白不是SARS-CoV复制所必需的，但缺乏E蛋白导致其毒力减弱。E蛋白不仅能改变宿主细胞膜的渗透性[9]，而且能作用于PALS1（参与上皮细胞紧密连接的一种蛋白质），破坏肺上皮细胞的紧密连接[10]。

N蛋白的氨基酸序列相对保守，与RNA结合形成核衣壳，相对分子质量为50 000～60 000，位于包膜内，其特异性抗体在体外不能中和SARS-CoV。SARS-CoV N蛋白组装入病毒样颗粒的主要功能区位于N蛋白168～421氨基酸残基[11]。N蛋白常被用于血清学诊断。

3a蛋白由开放读框3编码，包含274个氨基酸残基，位于S与E蛋白之间，相对分子质量约31 000，是SARS-CoV最大的辅助蛋白。3a蛋白是包含3个跨膜区的O型糖基化蛋白，不仅能活化NF-κB、上调上皮细胞纤维蛋白原表达促进SARS-CoV的感染，也能促进破骨细胞生成[12]。尽管3a蛋白能插入VLP，但3a蛋白不是SARS-CoV组装所必需的。恢复期病人的血清中能检测到3a特异性抗体。

多项研究表明，SARS-CoV的M蛋白与E蛋白或N蛋白同时表达能组装成VLP，M蛋白对病毒颗粒的组装至关重要。此外，S蛋白的2个软脂酰化半胱氨酸（C1234/1235）是S蛋白组装入VLP必不可少的，但不参与M-S共定位，M-S共定位和S蛋白组装入VLP彼此是相互独立的[13]。最近，Tseng等发现SARS-CoV M蛋白具有自我组装并以包膜小泡形式释放到胞外的能力，和N蛋白同时表达能组装成VLP[8，14]。体外实验也表明，SARS-CoV M 蛋白的保守区是介导M-M相互作用的基础，N蛋白与M蛋白相互作用促进包膜蛋白复合物的组装[7]。

2 SARS-CoV病毒样颗粒的制备方法

对病毒感染性疾病而言，VLP是一种理想的疫苗形式。形态上，VLP类似未成熟的病毒粒子；功能上，具有天然病毒的类似嗜性，通过和病毒感染一样的途径呈递给免疫细胞，激发强有力的特异性体液和细胞免疫[15]。目前获准用于人类的VLP疫苗包括乙型肝炎病毒疫苗、人乳头瘤病毒疫苗和戊型肝炎病毒疫苗，已在人群中广泛应用并取得良好效果。同时，许多病毒的VLP也被用于基础性研究，如病毒的组装机制及结构研究、病毒与宿主或蛋白与蛋白之间的相互作用[8，13-14]。

多种表达系统可用于制备病毒样颗粒，包括原核表达系统、酵母表达系统、杆状病毒/昆虫细胞表达系统（B/IC）、哺乳动物细胞表达系统和转基因植物。其中B/IC和哺乳动物细胞表达系统均能进行蛋白质翻译后修饰并易于快速生产，是应用最为广泛的VLP制备技术平台。

2.1 杆状病毒/昆虫细胞表达系统

杆状病毒表达系统是以杆状病毒为外源基因载体、昆虫细胞或活体昆虫为受体的真核表达系统。杆状病毒能容纳大片段的外源基因，关闭宿主细胞早期基因转录而高水平表达目的蛋白，并能进行简单的翻译后修饰。重组杆状病毒制备简单、快速，能在10～12周内完成新病毒VLP疫苗的生产，特别是一些表面蛋白易于突变的病毒如流感病毒、冠状病毒等。B/IC系统的主要缺点是同时表达大量难以与VLP分离的杆状病毒粒子，其具有佐剂活性，如果不去除或灭活，能显著增加VLP的免疫原性[16]。除此之外，超速离心是纯化VLP的主要方法，难以满足大规模生产的需求。

用B/IC系统制备SARS-CoV VLP须同时表达M蛋白和E蛋白[17]，在昆虫细胞内能组装成稳定光滑类似于SARS-CoV粒子的球形VLP；若同时表达S蛋白，则能高效组装和释放分泌型VLP[18]；同时表达3a蛋白、M蛋白和E蛋白，3a蛋白也组装进VLP[17]。Liu等利用B/IC系统同时表达SARS-CoV的S蛋白和流感病毒M1基质蛋白，组装成了高产量的嵌合型S/M1 VLP，免疫小鼠后可诱导SARS-CoV S蛋白特异的免疫应答及中和抗体，并获得有效保护[19]。Bai等同时表达SARS-CoV的M、E蛋白和SARS样CoV（SARS-like CoV，SL-CoV）的S蛋白，也成功获得嵌合型VLP，S蛋白插入了VLP表面[20]。因此，应用B/IC系统制备SARS-CoV VLP，必须至少同时表达M蛋白和E蛋白。

2.2 哺乳动物细胞表达系统

哺乳动物细胞表达系统是以质粒作为外源基因载体、哺乳动物细胞为宿主的真核表达系统，能够指导蛋白质的正确折叠，进行复杂的糖基化、磷酸化和乙酰化等多种翻译后加工功能，表达的产物在分子结构、理化特性和生物学功能方面都最接近于天然高等生物蛋白质，并且在蛋白合成起始信号、加工、分泌等方面具有独特优势。哺乳动物细胞表达系统类似于BI/C，能表达单个结构蛋白或多个结构蛋白的VLP（多达5个结构蛋白），表达水平大多都能达1 mg/L。哺乳动物细胞表达系统的主要不足之处是复杂的上、下游处理所需的高生产成本、表达产量低和可控性低。

应用哺乳动物细胞表达系统生产SARS-CoV VLP的研究表明，M蛋白和N蛋白是形成SARSCoV VLP的必需结构蛋白[8，14]，缺乏M蛋白和（或）N蛋白均不能形成VLP[21-22]。除此之外，Hsieh等发现M蛋白和E蛋白必须同时表达才能形成SARS-CoV VLP[23]；Xu等进一步证实9b蛋白必须和M蛋白、E蛋白同时表达才能组装入VLP，而不是依赖于N蛋白或S蛋白的表达[24]。但是，Siu等表明，M蛋白、E蛋白必须和N蛋白同时表达才能有效地组装和释放SARS-CoV VLP[25]。Lokugamage等分别同时表达SARS-CoV、小鼠肝炎病毒（MHV）的4个结构蛋白，均能组装成VLP，且MHV VLP的产量较SARSCoV VLP高17倍。同时，Lokugamage等将SARSCoV的S蛋白与MHV的M蛋白、N蛋白、E蛋白同时表达，其嵌合VLP产量较SARS-CoV VLP高8倍。Lokugamage等通过用不同的转染试剂和用不同浓度的质粒转染不同的细胞系，表明293T细胞来源的嵌合VLP产量较Vero细胞高10倍[15]。

3 SARS-CoV VLP疫苗诱导的免疫应答特点与安全性

多项研究表明，SARS-CoV VLP免疫小鼠后能引起强有力的特异性体液免疫和细胞免疫[18-19,26]。SARS-CoV VLP可活化未成熟树突状细胞高表达共刺激分子CD40、CD86、CD80和成熟标记分子CD83，分泌细胞因子IL-6、IL-10、IL-4、TNF-α和TNF-γ，从而激活初始T细胞[20]。由于TNF-γ明显高于IL-4，树突状细胞主要诱导初始CD4+T细胞分化为Th1细胞。皮下注射VLP的小鼠也能检测到IL-4和TNF-γ增高，且 TNF-γ比 IL-4高 9倍[18]。SARSCoV VLP经腹腔注射或滴鼻免疫都能诱导血清特异性IgG升高，滴鼻组血清滴度相对较低，但局部黏膜sIgA的升高很明显[26]。VLP肌注或滴鼻，在有或无佐剂的情况下都能完全保护攻毒的小鼠，抑制肺内病毒复制[15,19]。

Tseng等报道，SARS-CoV VLP免疫小鼠产生中和性抗体的同时，也导致肺组织产生了Th2型免疫病理损害[27]，类似于儿童接种灭活呼吸道合胞病毒疫苗后引起的免疫病理反应，他们认为N蛋白可能是引起肺组织免疫病理的主要抗原。因此，SARSCoV VLP抗原选择与应用的安全性问题仍待进一步研究确认。

4 结语

近30年来，VLP大规模制备与纯化技术已得到快速发展，迄今已有110余个VLP被制备及应用评估。与SARS-CoV亚单位蛋白或多肽相比，VLP类似于天然病毒，能提呈多种构象表位，诱导有效的体液和细胞免疫反应。更重要的是，对于高致病性的SARS-CoV，VLP不含SARS-CoV的基因组，无感染性，无须灭活或减毒，无生物安全隐患。尽管SARSCoV VLP疫苗具有很好的应用前景，但目前尚无SARS-CoV VLP疫苗产品获准在人群中应用评价，其抗原选择及制备工艺有待进一步优化，VLP疫苗的应用策略与保护效果仍有待在大动物感染模型及人群中验证与改进。

[1] King A M Q,Adams M J,Lefkowitz E J,et al.Virus taxono⁃my,classification and nomenclature of viruses:ninth report of the International Committee on Taxonomy of Viruses[M].San Diego,CA:Academic Press,2012.

[2] Peiris J S,Yuen K Y,Osterhaus A D,et al.The severe acute respiratory syndrome[J].N Engl J Med,2003,349(25):2431-2441.

[3] Zaki A M,van Boheemen S,Bestebroer T M,et al.Isolation of a novel coronavirus from a man with pneumonia in Saudi Arabia[J].N Engl J Med,2012,367(19):1814-1820.

[4] Graham R L,Donaldson E F,Baric R S.A decade after SARS:strategies for controlling emerging coronaviruses[J].Nat Rev Microbiol,2013,11(12):836-848.

[5] Qiu M,Shi Y,Guo Z,et al.Antibody responses to individu⁃al proteins of SARS coronavirus and their neutralization activi⁃ties[J].Microbes Infect,2005,7(5-6):882-889.

[6] Subbarao K,McAuliffe J,Vogel L,et al.Prior infection and passive transfer of neutralizing antibody prevent replication of severe acute respiratory syndrome coronavirus in the respirato⁃ry tract of mice[J].J Virol,2004,78(7):3572-3577.

[7] Arndt A L,Larson B J,Hogue B G,et al.A conserved do⁃main in the coronavirus membrane protein tail is important for virus assembly[J].J Virol,2010,84(21):11418-11428.

[8] Tseng Y T,Wang S M,Huang K J,et al.Self-assembly of severe acute respiratory syndrome coronavirus membrane pro⁃tein[J].J Biol Chem,2010,285(17):12862-12872.

[9] Pervushin K,Tan E,Parthasarathy K,et al.Structure and in⁃hibition of the SARS coronavirus envelope protein ion channel[J].PLoS Pathog,2009,5(7):e1000511.

[10]Teoh K T,Siu Y L,Chan W L,et al.The SARS coronavi⁃rus E protein interacts with PALS1 and alters tight junction formation and epithelial morphogenesis[J].Mol Biol Cell,2010,21(22):3838-3852.

[11]Wang S M,Chang Y F,Chen Y M,et al.Severe acute respi⁃ratory syndrome coronavirus nucleocapsid protein confers abili⁃ty to efficiently produce virus-like particles when substituted for the human immunodeficiency virus nucleocapsid domain[J].J Biomed Sci,2008,15(6):719-729.

[12]Obitsu S,Ahmed N,Nishitsuji H,et al.Potential enhance⁃mentofosteoclastogenesisby severe acute respiratory syn⁃drome coronavirus 3a/X1 protein[J].Arch Virol,2009,154(9):1457-1464.

[13]Ujike M,Huang C,Shirato K,et al.Two palmitylated cyste⁃ine residues of the severe acute respiratory syndrome coronavi⁃rus spike(S)protein are critical for S incorporation into vi⁃rus-like particles,but not for M-S co-localization[J].J Gen Virol,2012,93(Pt 4):823-828.

[14]Tseng Y T,Chang C H,Wang S M,et al.Identifying SARSCoV membrane protein amino acid residues linked to viruslike particle assembly[J].PLoS One,2013,8(5):e64013.

[15]Lokugamage K G,Yoshikawa-Iwata N,Ito N,et al.Chimeric coronavirus-like particles carrying severe acute respiratory syn⁃drome coronavirus(SCov)S protein protect mice against chal⁃lenge with SCoV[J].Vaccine,2008,26(6):797-808.

[16]Hervas-Stubbs S,Rueda P,Lopez L,et al.Insect baculovirus⁃es strongly potentiate adaptive immune responses by inducing type I IFN[J].J Immunol,2007,178(4):2361-2369.

[17]Khan S,Ng M L,Tan Y J,et al.Expression of the severe acute respiratory syndrome coronavirus 3a protein and the as⁃sembly of coronavirus-like particles in the baculovirus expres⁃sion system[J].Methods Mol Biol,2007,379:35-50.

[18]Lu X,Chen Y,Bai B,et al.Immune responses against se⁃vere acute respiratory syndrome coronavirus induced by viruslike particles in mice[J].Immunology,2007,122(4):496-502.

[19]Liu Y V,Michael M J,Barnardb D L,et al.Chimeric severe acute respiratory syndrome coronavirus(SARS-CoV)S glycopro⁃tein and influenza matrix 1 efficiently form virus-like particles(VLPs)that protect mice against challenge with SARS-CoV[J].Vaccine,2011,29(38):6606-6613.

[20]Bai B,Hu Q,Hu H,et al.Virus-like particles of SARS-like coronavirus formed by membrane proteins from different ori⁃gins demonstrate stimulating activity in human dendritic cells[J].PLoS One,2008,3(7):e2685.

[21]Hatakeyama S,Matsuoka Y,Ueshiba H,et al.Dissection and identification of regions required to form pseudoparticles by the interaction between the nucleocapsid(N)and membrane(M)proteins of SARS coronavirus[J].Virology,2008,380(1):99-108.

[22]Nakauchi M,Kariwa H,Kon Y,et al.Analysis of severe acute respiratory syndrome coronavirus structural proteins in virus-likeparticle assembly[J].MicrobiolImmunol,2008,52(12):625-630.

[23]Hsieh P K,Chang S C,Huang C C,et al.Assembly of se⁃vere acute respiratory syndrome coronavirus RNA packaging signal into virus-like particles is nucleocapsid dependent[J].J Virol,2005,79(22),13848-13855.

[24]Xu K,Zheng B J,Zeng R,et al.Severe acute respiratory syn⁃drome coronavirus accessory protein 9b is a virion-associated protein[J].Virology,2009,388(2):279-285.

[25]Siu Y L,Teoh K T,Lo J,et al.The M,E,and N structural proteins of the severe acute respiratory syndrome coronavirus are required for efficient assembly,trafficking,and release of virus-like particles[J].J Virol,2008,82(22):11318-11330.

[26]Lu B,Huang Y,Huang L,et al.Effect of mucosal and sys⁃temic immunization with virus-like particles of severe acute respiratory syndrome coronavirus in mice[J].Immunology,2010,130(2):254-261.

[27]Tseng C T,Sbrana E,Iwata-Yoshikawa N,et al.Immuniza⁃tion with SARS coronavirus vaccines leads to pulmonary im⁃munopathologyon challengewith theSARS virus[J].PLoS One,2012,7(4):e35421.