噬菌体展示抗克伦特罗抗体文库的构建及单克隆抗体的筛选

董金华唐玉海乔宁韩金宏董美华董益阳

（1. 潍坊科技学院生物工程研发中心，山东 262700；2.北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029）

噬菌体展示抗克伦特罗抗体文库的构建及单克隆抗体的筛选

董金华1唐玉海1乔宁1韩金宏1董美华1董益阳2

（1. 潍坊科技学院生物工程研发中心，山东 262700；2.北京化工大学生命科学与技术学院，北京 100029）

利用小白鼠免疫和噬菌体展示技术构建了噬菌体展示抗体文库，从文库中筛选获得了一株抗克伦特罗单克隆抗体。该抗体的氨基酸序列尚未在世界基因数据库中登录，是一个新的抗体。该抗体对于游离克伦特罗的半抑制率IC50为0.602 μg/mL。该噬菌体展示的抗体片段可以用于竞争法检测克伦特罗的含量，其能够检测出的最低浓度为15.6 ng/mL，具有较大的实用价值。

克伦特罗 抗体 噬菌体展示 免疫检测

盐酸克伦特罗（Clenbuterol，CLEN）是一种β2受体激动剂，属于拟肾上腺素类药物，分子量为313.7［1］。20世纪80年代初，美国的一家公司发现盐酸克伦特罗可以明显地促进动物的生长，并能有效地增加瘦肉率［2］，它能够改变动物体内的代谢途径，促进肌肉特别是骨骼肌中蛋白质的合成，抑制脂肪的合成，从而加快家畜生长速度，相对增加瘦肉比例。这一新发现很快被一些国家用于养殖业。饲料中添加了盐酸克伦特罗后，可使猪牛羊等畜禽生长速度、饲料转化率及胴体瘦肉率提高10%以上，所以盐酸克伦特罗作为饲料添加剂一度被广泛使用。

但是后来科学家们发现人类过度摄入克伦特罗会引起巨大的不良反应，严重的可能会发生急性中毒，甲状腺功能亢进，心律失调等症状［3］。20世纪80年代末期开始，在世界各地发生了多起克伦特罗中毒事件，我国在近几年也时有发生。1997年中国香港17位居民因食用含有克伦特罗的猪内脏而中毒；1998年中国大陆首次发生的“瘦肉精”中毒事件，2001年在浙江省桐庐县因食用被克伦特罗污染的猪肉及猪内脏而导致180余人中毒，广东省河源市发生特大瘦肉精中毒事件，共484人中毒；2006年上海连续发生“瘦肉精”食物中毒事故，300多人中毒；2011年3月15日，央视“3·15”特别节目《“健美猪”真相》再一次将瘦肉精推到风口浪尖。另外，近几年有些运动员也因误食被克伦特罗污染的猪肉而被检出体内有兴奋剂而受到影响。2004年3月，国家食品药品监督管理局、公安部、农业部、商务部、卫生部等八个部局联合发布文件，阻止违禁添加剂留下养殖行业，加强对瘦肉精的防堵。但此后依然有生产商非法制造、销售及使用该化学药品。目前对该药品的检测多使用液相色谱或者气相色谱，而上述方法均需要昂贵的设备及仪器，很难普及应用。

利用抗体测定抗原的方法叫免疫测定法（Immunoassay），该方法不需要大型且昂贵的设备，相对来说实施容易，测定成本低，近几年来得到了很大的发展。抗体技术经历了多克隆抗血清及单克隆抗体的开发，现在已经发展到了基因工程抗体阶段。 抗体的抗原结合片段（Fragment，antigen binding，Fab）及单链抗体（Single chain variable region，ScFv）作为基因工程抗体的代表，具有与全长抗体同等的抗原结合功能，可以取代全长抗体用于免疫学测定［4］。 抗体Fab片段包含有抗体的轻链（Light chain）和重链的可变领域（Variable region，VH）及一个恒定领域（Constant region 1，CH1），在保持有抗体原有的抗原结合功能的同时，又具有很强的稳定性。Fab片段的分子量只有抗体分子量的1/3，因此在用于医药时同ScFv片段相似，具有组织传透能力强，免疫原性低等优点［5］。噬菌体抗体展示技术最早是在20世纪90年代初由Winter等开发成功［6］。该技术的核心是通过将抗体的表型和基因型相联系，从构建的抗体库中筛选抗体的同时可以获得编码该抗体的基因，为目前抗体开发中最常用的技术之一。

本研究使用牛血清蛋白与克伦特罗的偶联物（BSA-CLEN）对小白鼠进行免疫，利用噬菌体展示技术构建噬菌体展示抗体文库，并通过对该偶联物进行淘筛获得一株能够与克伦特罗特异结合的抗体。

1 材料与方法

1.1 材料

克伦特罗与牛血清蛋白的偶联物（BSA-CLEN）系购自杭州南开日新生物技术有限公司；游离盐酸克伦特罗购自中国药品生物制品检定所；总RNA 提取试剂盒购自北京百泰克生物技术有限公司；大肠杆菌DH5α购自TaKaRa 生物技术有限公司；大肠杆菌TG-1购自Amersham Bioscience（日本东京）；克隆基因用的限制性内切酶、聚合酶等均购自TaKaRa生物公司；其他试剂均为国产分析纯。

载体pIT2 源自英国MRC。辅助噬菌体M13-KO7购自New England Biolabs（MA，USA）。

扩增抗体用的引物是根据GenBank数据库中鼠源抗体重链及轻链可变领域基因序列及其他文献中的序列设计并由Invitrogen Inc.（日本东京）合成。所用引物的序列见表1。

1.2 方法

免疫小白鼠后提取脾脏细胞的总RNA，并以其为模板扩增抗体的基因，用限制性内切酶处理后的抗体基因克隆至噬菌体展示载体，转染感受态大肠杆菌，制作抗体展示文库。固定抗原后对该抗体文库进行淘筛，最后获得具有克伦特罗特异性的单克隆抗体（图1）。

1.2.1 动物试验 两只BALB/c小白鼠用于BSA-CLEN免疫。免疫隔周进行4次，每次用量为100 μg。完全弗氏佐剂用于增加免疫效果。最后一次免疫1周后，从小白鼠的尾部取血确认免疫效果。免疫成功后，提取小白鼠脾脏细胞，用于提取总RNA。

1.2.2 脾细胞总RNA的提取 按照试剂盒的说明，运用Trizol法提取总RNA，并对之进行甲醛变性琼脂糖电泳分析。同时通过紫外分光光度法测定总RNA的纯度。

1.2.3 扩增抗体可变区域的基因 抗体可变区域的基因是利用TaKaRa公司的PrimeScript One Step RTPCR Kit Ver.2进行扩增。根据试剂盒说明书，首先利用PrimeScript®RTase以RNA为模板合成cDNA，然后直接在反应系中利用TaKaRa Ex Taq®HS完成抗体基因的VH和VL扩增。扩增条件为94℃预变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，进行35个循环后72℃延伸10 min，1.5%琼脂糖凝胶电泳对PCR扩增产物进行检测，并使用胶回收试剂盒回收扩增产物。

1.2.4 构建抗体文库载体 使用限制性内切酶SalI和NotI将回收的抗体可变领域基因VL消化并纯化后，将其与用同样酶处理的pIT2载体［7］连接，连接反应使用TOYOBO的Ligation High Ver.2进行30 min，然后将连接产物转化进大肠杆菌DH5α感受态细胞，稀释培养菌液滴定VL文库库容的大小，培养剩余大肠杆菌过夜提取质粒。将载体进行SfiI和XhoI双酶切处理后回收纯化目的片段，并使之与同样双酶切处理的VH基因连接，转化入大肠杆菌TG-1，滴定抗体文库的大小，随机挑斑进行培养并对抗体文库进行鉴定。培养剩余菌液用于制作噬菌体展示抗体文库。

1.2.5 制作抗体展示文库 使用2YTA液态培养基（含有100 μg/mL的Amp的2YT培养基） 培养转化后的大肠杆菌TG-1至OD600约为0.6，以MOI=20的比例加入辅助噬菌体M13-KO7（New England Biolabs，MA，USA），保持菌液在37℃ 30 min，然后以3 000×g的速度离心10 min，去上清后加入50 mL的2YTAK（含有100 μg/mL的Amp和50 μg/mL Kan的2YT培养基），悬浮菌体，30℃振荡培养过夜。

1.2.6 噬菌体展示抗体文库的回收 以1 000×g的速度离心培养菌30 min后，量取上清并加入1/4体积的PEG/NaCl溶液（20%聚乙二醇6000，2.5 mol/L NaCl），于4℃保持60 min，然后4℃，1 000×g的速度离心，完全弃上清后加入适量的高压灭菌的PBS溶液（KH2PO41.47 mmol/L；Na2HPO48.10 mmol/L；NaCl 136.89 mmol/L；KCl 2.68 mmol/L）将沉淀溶解，制得噬菌体展示抗体文库。滴定该抗体库的滴度，并用于抗体的筛选。

1.2.7 抗体的筛选 将100 μL的BSA-CLEN（10 μg/mL）分别加入到3个微孔中，4℃过夜；第2天倒掉溶液并加入MPBS（含有2%脱脂牛奶的PBS溶液）在室温下保持2 h封闭微孔；将1.2.6中回收的噬菌体溶液以MPBS稀释至109CFU/100 mL（CFU：Colony Form Unit）的浓度并在每个微孔中加100 μL，室温保持1 h；用PBST（含有0.1%TWEEN20的PBS溶液）在洗板机（BIO-RAD，1575）上洗板10次后用甘氨酸-HCl（pH2.7）将固定在微孔板上的噬菌体溶出；溶出的噬菌体用于感染大肠杆菌并制作第二轮淘筛用抗体文库。重复以上操作3次，浓缩抗体文库中的抗原特异抗体，并用ELISA法来鉴定抗原特异性抗体的浓缩效果。

1.2.8 单克隆抗体的筛选 在96孔培养用孔板内加入200 μL的2YTA培养基，挑取96个克隆并在37℃培养至OD600约为0.6，用辅助噬菌体感染菌体如1.2.6所述制作噬菌体；同时在96孔的微孔板内4℃过夜加入100 μL的BSA-CLEN（1 μg/mL），封闭后每个孔内加入100 μL的噬菌体溶液（80 μL的MPBS中加入20 μL的噬菌体溶液）并在室温下保持1 h；使用洗板机洗板3次后加入抗噬菌体抗体Anti-M13 antibody/HRP（GE health，MA，USA）；再 次在室温下保持1 h，洗板后加入底物TMBZ溶液（Sigma；100 μg/mL TMBZ和0.04 μL/mL H2O2in 100 mmol/L NaOAc，pH6.0）；室温保持5 min后加入10%的H2SO4终止反应，测定样品在450 nm波长下的吸光度。

1.2.9 单克隆抗体的分析 挑选8个阳性克隆A2、A3、B1、D1、E1、G12、H5及H6培养后委托上海生物工程有限公司对其序列进行了分析。重链和轻链序列解析用的引物分别为M13RV：5-GGAAACAGCTATGACCATG-3和pVLBack：5-CACTGGCTGGTTTCGCTAC-3。抗体序列的分析使用了GENYTYX 软件（GENETYX CORPORATION，日本东京），抗体可变领域的互补决定区（Complementarity-Determining Region，CDR）［8］的分析使用了NCBI IgBLAST（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/）。

1.2.10 竞争法测定溶液中克伦特罗的浓度［9］利用噬菌体展示的A2克隆测定了溶液中克伦特罗的浓度。即在96孔的微孔板上固定BSA-CLEN（1 μg/mL）后进行封闭，然后将噬菌体-抗体溶液和系列稀释的游离克伦特罗溶液（浓度为0、0.016、0.08、0.4、2和10 μg/mL）混合后加入到微孔中，每个浓度设置3个重复；室温下保持1 h后，用洗板机洗板，然后加入HRP修饰的抗噬菌体抗体，继续在室温下保持1 h，清洗微孔板后添加底物TMBZ显色，测定在波长450 nm下吸光度，绘制标准曲线。

2 结果

2.1 抗体基因的扩增

抗体重链及轻链可变区域的基因VH及VL得以成功扩增，如图2所示，VL基因的大小约为350 bp，VH基因稍大。虽然在目的条带的上方有两条非特异DNA也被扩增，但通过电泳后切出目的条带，不会对基因的克隆造成影响。

2.2 噬菌体展示抗体文库的构建

噬菌体展示抗体文库分两步构建，因为在抗体与抗原结合时，抗体的重链的作用大于轻链，所以为保证抗体文库库容中重链的多样性，首先将SalI和NotI双酶切处理的VL基因连接至目标载体，得到1个4.3×106的轻链文库。然后将用SfiI-XhoI处理的抗体重链基因连接到含有轻链抗体基因的载体内，转化大肠杆菌，完成了抗体文库的构建。经过滴定确定构建的抗体文库的库容为5.6×106CFU。

2.3 克伦特罗抗体的浓缩

通过噬菌体ELISA对特异抗体的浓缩效果做了鉴定。如图3所示，原始文库R0及淘筛过程中的3个子文库R1，R2，R3都不能跟BSA结合，而对于BSA-CLEN，虽然R0，R1噬菌体未与其结合，但使用了R2和R3噬菌体试验样的信号显著增加，其中R2的信号强度高于R3。这表明在R2和R3子抗体文库中能够跟BSA-CLEN特异结合的抗体明显增多，显示针对BSA-CLEN的淘筛获得成功。

2.4 单克隆抗体的筛选

制作了96种展示不同抗体克隆的噬菌体，并通过ELISA法对这96种噬菌体的抗原结合特性作了评价。结果如图4所示，数十个克隆显示了对BSACLEN的特异性。其中挑选8个阳性克隆A2、A3、B1、D1、E1、G12、H5及H6，对其序列进行了分析。2.5 抗体的序列

通过对挑选的8株抗体的序列分析发现，这8株抗体的基因序列完全相同，系同一个克隆。图5显示A2抗体的基因及氨基酸的序列。抗体重链的可变领域分为V片段，D片段及J片段，而轻链为V片段和J片段。每个片段的基因又由几个到几十个不同序列的基因组成，这些基因的自由组合构成了具有一个V-D-J编码的重链和一个V-J编码的轻链。 其自由组合在抗原刺激B细胞而形成浆细胞后完成，从而在V（D）J编码下分泌含有不同氨基酸的序列，产生多种多样的免疫应答。A2抗体重链的V片段与鼠源抗体IGHV3-21*04的相同性最大，为85.1%，D/J片段则与IGHD3-16*02及IGHJ4*02有100%的相同性。该抗体的轻链V片段与鼠源抗体轻链IGVKV-11*01相同性最大，为70.5%，其J片段为IGKJ4*02。在抗体数据库中没有检索到与A2抗体具有完全相同氨基酸序列的单克隆抗体，因此该抗体是一个新型抗体。

抗体可变区中的互补决定区CDR是与抗原表位直接结合的部位，决定该抗体的抗原特异性。图5方框内的序列为抗体可变区的6个互补决定区。

2.6 应用A2抗体测定溶液中克伦特罗的含量

利用噬菌体展示的抗体（Phage-A2Fab），竞争法（Competitive ELISA）测定溶液中克伦特罗的含量。结果如图6及表2所示，当溶液中游离的克伦特罗含量低时，溶液中的Phage-A2Fab跟固定在微孔板上的BSA-CLEN结合，洗板后在微孔中加入HRP修饰的抗噬菌体抗体，该抗体跟固定在微孔板表面的Phage-A2Fab结合，洗板后加入底物显色。因结合的Phage-A2Fab多，其最终的信号强度也大。而随着溶液中游离克伦特罗浓度的上升，溶液中部分Phage-A2Fab与游离的克伦特罗结合，因此跟微孔板上固定的BSA-CLEN结合的抗体便减少，信号的强度也逐渐降低。通过绘制标准曲线，求得该曲线的半抑制率（IC50）为0.602 μg/mL。同时以未添加抗原的样品的吸光度减去3倍标准偏差计算得出该测定法能够检测出克伦特罗的最低量（Limit of detection；LOD）为15.6 ng/mL。

3 讨论

抗体开发有着较长的历史，其中20世纪70年代开发的杂交瘤技术为制作单克隆抗体开创了先河［10］。而在其后由Winter等开发噬菌体展示技术则实现在了抗体的表型和基因型的连接，即在获得抗体的同时也能够得到抗体的基因，为开发抗体的分子药物奠定了基础。 抗原结合片段Fab与单链可变领域抗体片段（ScFv）因为具有分子小，组织穿透性好，在血液中的半衰期短等特点，相对于全长抗体具有很大的优势。

本研究通过用克伦特罗与BSA的偶联物免疫小白鼠及制作噬菌体展示抗体文库的方法克隆了一株抗克伦特罗的单克隆抗体A2。因为在现有的抗体数据库中没有检索到与A2具有相同序列的抗体，所以这是一个新的抗体。通过对A2抗体基因的分析发现，该抗体重链可变领域的CDR2部分由17个氨基酸组成，远远长于只有5-9个氨基酸组成的其他的CDR，这符合小分子及半抗原鼠源抗体的特点［11，12］。

利用免疫动物的抗体基因构建抗体文库，因为经过了免疫系统的选择压力，抗体文库中针对免疫抗原的特异性丰度高于其他非特异性抗体，其中一部分抗体经过了免疫系统的亲和力成熟过程，因此从这次构建的抗体中筛选到了具有高亲和力和特异性的抗体。一般而言，噬菌体展示抗体文库的库容与所筛选到的抗体的亲和力成正比关系，即库容越大，能够筛选到的抗体的亲和力就越大［13］。 尽管该抗体能够跟克伦特罗特异性结合并能应用于竞争法检测溶液中克伦特罗的含量，但因为受抗体文库库容的限制，其亲和性依然有较大的开发余地。噬菌体展示法的另外一个优势是可以通过制作合成抗体库完成抗体的试管内进化。今后我们将以该抗体为框架，并将其CDR的一部分随机变异，制作合成抗体文库并进行淘筛，开发具有更高亲和性的抗体。

在本研究中，将A2抗体应用于竞争法测定游离克伦特罗的浓度，其LOD为15.6 ng/mL。随着科学技术的进步，科学家们已经开发出了如Quenchbody Technology［14］，MusTag Technology［15］，及Phage-Immuno PCR［16］等测定迅速且灵敏度高的免疫测定方法。若将本研究中开发的A2抗体应用于以上科研成果，可开发出灵敏度更高，操作更加简单的克伦特罗检测技术。

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（责任编辑 李楠）

Construction of a Phage-displayed Anti-clenbuterol Antibody Library and Selection of Monoclonal Antibody

Dong Jinhua1Tang Yuhai1Qiao Ning1Han Jinhong1Dong Meihua1Dong Yiyang2
（1. Department of Research and Development，Weifang University of Science and Technology，Shandong262700；2. College of Life Science and Technology，Beijing University of Chemical Technology，Beijing100029）

An anti-clenbuterol antibody was developed by immunization of mouse and construction of a phage displaying antibody library. The antibody has a novel sequence and the utilization of gene segments in germline was also identified. With this antibody, a competitive assay was performed and gave a limit of detection of 15.6 ng/mL. The IC50of phage-antibody with free clenbuterol against immobilized bovine serum albumin conjugated clenbuterol was 0.602 μg/mL. All the results suggested that the antibody is useful in practical applications.

Clenbuterol Monoclonal antibody Phage display Detection

2013-08-12

潍坊科技学院校级课题（博士基金）（W13K007）

董金华，男，副教授，研究方向：生物学；E-mail：newbio2010@gmail.com